牡丹花芽休眠解除相关基因PsPⅡ的克隆及其表达的初步分析.pdf

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1、CloningandPrelimmaryExpressl·onAnalysisofPsPIIGeneAssociatedwiththeRelease。ofDormantBudSillTreePeony(Paeoniasuffruticosa)ThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirement，fortheDegreeofMaster-of1ScienceZhangXiaoling(DepartmentofLifeScience)Supervisor：MuPingQing

2、dao．ChinaJune，2011青岛农业大学硕士学位论文目录摘要Abstraet⋯⋯第一章文献综述1本项研究的目的及意义1．1研究目的1．2研究意义目录⋯⋯111⋯12国内外研究进展2．1植物芽休眠现象及内休眠解除原理的研究进展⋯。2．1．1芽休眠的定义与分类1．22．1．2内休眠诱导及解除过程中的代谢变化⋯。2．1_3内休眠的分子调控机制．2．2牡丹芽内休眠的研究进展2．2．1牡丹的休眠特性3⋯．32．2．2低温对解除牡丹内休眠的作用．．2．2．3激素在牡丹内休眠解除中的作用2．2．4牡丹花芽内休眠解除激素相关基因的分离2．2．5PH蛋白的研究现状3全长eDNA

3、的获得—RACE简介4本项研究的技术路线第二章牡丹PsPII全长eDNA的获得及RNA水平表达分析1实验材料⋯。1．1菌株与载体1．2供试材料．1．3材料处理与取样1．4主要酶及试剂1．5主要缓冲液．1．6仪器2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯11122．1基因PsPII全长eDNA的扩增⋯⋯⋯2．1．1牡丹花芽总RNA的提取及检测⋯⋯⋯⋯。2．1．2总RNA中基因组DNA的酶解⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1345678青岛农业大学硕士学位论文目录2．1．3PsPII基因全长eDNA的扩增(RACE-PCR)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．2PH蛋白的生物信息学分

4、析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．3实时荧光定量PCR进行表达分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。212．3．1不同低温处理的牡丹花芽RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯2．3．2eDNA第一链的合成(M-MLVReverseTranscriptase，NEB)2．3．3Real-timePCR引物的设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2．3．4Real-timePCR反应222．4northernblotting分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．4．

5、15个低温处理的总RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．4．2RNA的1．2％的甲醛变性胶电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2．4．3DIG标记探针的制各⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2．4．4转膜及RNA的固定⋯2．4．5杂交2．4．6洗膜和免疫检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。3．1鲁荷红休眠解除所需低温量的调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2总RNA完整性和纯度检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．3PsPII基因全长eDNA序列

6、和氨基酸序列的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．4PsPII生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3．4．1PsPII基因全长cDNA序列与氨基酸序列的生物化学特性分析3．4．2PH蛋白的信号肽与跨膜结构域预测及其亚细胞的定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3．4．3PH蛋白序列的同源性分析与构建进化树⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．27⋯⋯2727⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．4．4功能结构域预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．5PsPII的实时定量PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．5．1引物质量评估⋯⋯⋯

7、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．333．5．2标准曲线、融解曲线与扩增曲线的分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。343．5．3PsPII基因在低温解除牡丹休眠花芽中的差异表达分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．6PsPII的northern杂交检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4讨论⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。35⋯⋯364．1高质量总RNA的提取是克隆目的基因的关键⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。364．2全长cDNA序列的判定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯