铁皮石斛doni基因的克隆及其表达分析

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1、分类号＾密级公巧ＵＤＣ６３０全曰制硕±专业学位研究生学位论文铁皮石解。ｏｉＶ廬因的克隆及其表达分析作者姓名；曹晓菲＊巧导教师：段承側副教授专业学俭名称；农化推广硕±领域名務：研究方向：药用植物遗传改良所在学院：化＃与半物巧术学院义摇巧日期：２０１５年１２月１８ｙ浙江农林大学２０１５年１２月ZhejiangAgriculture&ForestryUniversityMasterDegreeThesisCloningandExpressionAnalysisofDoNIGenesinDendrobiumoff

2、icinaleCandiadate:CAOXiao-feiAdviser:DUANCheng-li,AssociateProfessorSpeciality:ForestryDateofSubmission:October12,2015ZhejiangA&FUniversityLin’an,zhejiangprovince,P.R.ChinaOctober,2015独创性声明本人声明，所呈交的学位论文，是受林学开放基金（KF201319）和浙江省重大科技专项（2012C12912-9的项目资助，在指导教师段承俐的指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文

3、中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位论文作者亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。□不保密,本学位论文属于不保密。□（请在方框内打“

4、√”）学位论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：摘要摘要铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）属兰科（Orchidoideae）石斛属(Dentrobium)多年生草本植物，为我国传统名贵药材。多糖是其主要活性成分，与铁皮石斛的增强机体免疫机能、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、降血糖等多种药理作用密切相关，也是目前评判铁皮石斛品质的主要指标。多糖的合成以蔗糖为前体物质，因此与蔗糖代谢密切相关。中性/碱性转化酶（NI）将蔗糖不可逆地降解为葡萄糖和果糖，以满足植物代谢中对己糖的需要，在植物蔗糖代谢与调控中发挥着重要作用。本研究通过同源克隆、R

5、T-PCR和RACE技术，对铁皮石斛中性/碱性转化酶基因进行克隆，分析其在铁皮石斛中的时空表达，同时研究低温、pH及外源添加物等对其基因表达的影响，构建该基因的遗传转化载体并进行异源转化，初步揭示NI在铁皮石斛中的功能、表达及影响其表达的因素，为石斛多糖的代谢调控及铁皮石斛的品质育种提供理论依据。本文取得的主要结果如下：（1）利用GenBank油棕NI基因序列，采用RT-PCR和RACE的方法首次从铁皮石斛中克隆得到中性/碱性转化酶基因的全长cDNA序列，并命名为DoNI（GenBank登录号KP742351），序列长度为2231bp，开放阅读框长1665bp，编码554个氨基

6、酸，相对分子量为62.8kD，等电点为6.56，具有中性/碱性转化酶保守结构域，其编码的氨基酸序列与的禾本科植物小米和短花药野生稻的亲缘关系最近，与单子叶其他植物油棕、海枣及小果野蕉也有较近的亲缘关系，属于同一进化分支。（2）利用实时荧光定量PCR研究铁皮石斛DoNI基因的时空表达，结果显示：其在铁皮石斛的根、茎、叶中均有表达，但在茎中的表达量最高；DoNI基因在组培苗与地栽植株不同生长阶段的表达也有差异，且变化趋势一致，表达量从高到低的排序是12月份＞4月份＞8月份，与多糖含量的变化趋势完全一致。（3）许多因素均会影响DoNI基因在铁皮石斛中的表达，其表达最适的pH是7.0，

7、过酸或过碱的条件均会降低其基因的表达；外源Ca2+和Mn2+处理可明显增加DoNI基因的表达量，Mn2+的处理效果优于Ca2+；外源ABA处理可显著提高DoNI基因的表达，且表达量随ABA处理时间的增加而逐渐上升，在处理48h时达到峰值；适当增加培养基中的蔗糖浓度，也可提高铁皮石斛DoNI基因的表IV摘要达。低温处理初期DoNI基因的表达会增加，但随着低温胁迫的加重和处理时间的延长，其表达会大幅下降且明显低于对照；NaCl处理也能促进DoNI基因的表达，在处理24h时达到峰值，此后随着处理时