铁皮石斛dxs、dxr、hdr的克隆与功能分析

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1、分类号：单位代码：10364密级：学号：12720427安徽农业大学学位论文铁皮石斛DXS、DXR、HDR的克隆与功能分析MolecularCloningandExpressionAnalysisofDXS、DXR、HDRinDendrobiumofficinaleKimuraetMigo研究生：吴秋菊指导教师：樊洪泓副教授合作指导教师：高致明教授申请学位门类级别：理学硕士专业名称：遗传学研究方向：分子遗传学所在学院：生命科学学院答辩委员会主席：年月独创性声明本人芦明所單交的论文匙我个人在导师指导下进巧的研究Ｉ：Ｉ

2、作及取得的研究成果，．。尽我所知除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外论文中不包含其他人己经发巧或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料＇。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年（月曰／关于论文使用授权的说明，目Ｐ本人完全了解安徽农业大学有关保留：学校有权保留、使用学位论文的规定送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同

3、意安徽农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）ｒｆ（研究生签名：義緣马时间：Ｗ年弓口第哥师答么義时间：如辟历円／Ｉ本论文得到了以下科研项目的资助：安徽省科技攻关项目（1301032139）安徽省生物学重点学科建设项目大别山区农林特色产业协同创新中心安徽省中药材产业体系摘要铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo是珍稀的石斛属药用植物之一，具有益胃生津、滋阴清热等功效。生物碱是铁皮石斛主要药用成

4、分之一，其生物碱大多属于倍半萜类生物碱或萜类吲哚生物碱，两类生物碱生物合成均起源于萜类途径（MVA、MEP途径）。1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）、1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶（HDR）是MEP途径中的关键酶，然而铁皮石斛DXS、DXR、HDR信息及其相关功能至今未见报道。本论文主要克隆了铁皮石斛DXS、DXR、HDR的cDNA全长并进行功能分析，旨在研究DXS、DXR、HDR在铁皮石斛生物碱合成途径中的作用。主要结果如下：（

5、1）采用RT-PCR和RACE等方法克隆得到铁皮石斛DoDXS、DoDXR、DoHDR全长（GenBank登录号分别为KF803334、KF412827、KC344827）。（2）组织特异性表达分析表明，DoDXS、DoDXR、DoHDR在铁皮石斛各个组织中都有表达；其中DoDXS在原球茎中表达量最高，是叶的3.86倍；DoDXR在茎中表达量最高，是原球茎的2.26倍；DoHDR在叶中表达量最高，是原球茎的2.72倍。（3）通过茉莉酸甲酯（MeJA）处理后，DoDXS的表达量在12h显著升高，48h达到高峰，上升5.1

6、7倍，之后下调；但DoDXR、DoHDR却不受MeJA诱导。水杨酸（SA）处理4h后，DoDXS、DoDXR、DoHDR表达量均显著升高，最高值分别为对照的5.46、5.25、3.36倍。脱落酸（ABA）均诱导DoDXS、DoDXR、DoHDR的表达量上升，峰值分别为对照的2.82、4.49、6.37倍。油菜素内酯（BR）均诱导DoDXS、DoDXR、DoHDR的表达，24h达到峰值，分别为对照的1.59、2.27、1.26倍。（4）成功构建真核表达载体pCambia1301-DoDXS、pCambia1301-DoD

7、XR、pCambia1301-DoHDR。亚细胞定位分析表明DoDXS、DoDXR、DoHDR均定位于叶绿体上。通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥，获得DoDXS-T2代转基因植株9个株系，且DoDXS都获得超表达；获得DoDXR-T1代拟南芥转基因植株DoDXR-T1代30株。（5）利用MVA和MEP途抑制剂——洛伐他汀和膦胺霉素，研究铁皮石斛生物碱的生物合成途径；试验结果表明，洛伐他汀对铁皮总石斛生物碱生物合成的抑制率为26.27%，膦胺霉素对铁皮总石斛生物碱生物合成的抑制率为33.62%；并推测MEP途径在铁皮石斛

8、生物碱的生物合成中占主要作用。通过酶活性检测，发现MVA、MEP两个不同的萜类代谢途径，有明显的交互调节机制。关键词：铁皮石斛，DoDXS、DoDXR、DoHDR，基因克隆，表达分析，亚细胞定位，遗传转化IAbstractDendrobiumofficinaleKimuraetMigoisoneofraremedicinalDen