铁皮石斛4cl基因的克隆与序列分析 毕业论文

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1、安徽农业大学毕业论文（设计）论文题目铁皮石斛4CL基因的克隆与序列分析姓名学号10197016学院生命科学学院专业生物技术指导教师职称副教授中国·合肥二零一四年五月目录中文摘要1关键词11.材料与方法21.1试验材料21.2试验试剂21.3试验方法21.3.1铁皮石斛总RNA的提取与cDNA第一链的合成21.3.2引物设计21.3.3铁皮石斛4CL基因cDNA核心片断的获得21.3.45'RACE和3'RACE扩增21.3.5铁皮石斛4CL基因全长cDNA的克隆31.3.6序列分析32.结果与分析32.1铁皮石斛总RNA提取质量的检测32.2

2、铁皮石斛4CL基因核心片段的克隆与鉴定32.3铁皮石斛4CL基因的RACE扩增与序列鉴定42.4铁皮石斛4CL基因全长cDNA的克隆与鉴定52.5氨基酸序列序列比对和进化分析53.讨论7参考文献8Abstract9Keywords9致谢9铁皮石斛4CL基因的克隆与序列分析（安徽农业大学生命科学学院2010级生物类创新实验班，合肥230036）摘要：本试验采用同源扩增技术和cDNA末端快速扩增（rapidamplificationofcDNAendsRACE）技术对铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）中的4-香豆酸：辅酶A连接酶

3、（4-Coumarate:CoenzymeALigase4CL）基因进行克隆。根据基因的保守性，利用NCBI数据库中其他植物的4-香豆酸：辅酶A连接酶的氨基酸保守区设计简并引物。序列分析表明，该基因全长为1650bp，编码549个氨基酸，具有4CL基因家族的特异序列。系统进化树分析显示，4CL的氨基酸序列进化方向与植物基本保持一致，符合从低等到高等、从简单到复杂的演变过程。对铁皮石斛4CL基因的克隆，为进一步研究4CL基因参与的植物次生代谢途径奠定了基础。关键词：铁皮石斛；4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）；基因克隆铁皮石斛（Dendrobi

4、umofficinaleKimuraetMigo）为兰科石斛属多年生附生草本植物，因表皮呈铁绿色而得名。按形态、产地等分类，石斛属植物可分为铁皮、金钗、霍山、黄草、环草、马鞭等数十个品种，其中以铁皮石斛最为珍贵。研究表明铁皮石斛具有生津养胃、滋阴清热、护肝利胆、明目强腰的功效，此外还具有抗肿瘤、降血糖、增强机体免疫力、抗氧化衰老等疗效。在植物界，铁皮石斛素有“软黄金”“千金草”之盛誉，是民间传说中的“救命仙草”，国际上称其为“药界大熊猫”。野生铁皮石斛多生于海拔100~3000m之间的山地半阴岩石或树皮上，喜温暖湿润气候和半阴湿的环境，不耐寒

5、[1]。由于它生长及繁殖条件十分苛刻，自然产量极为稀少，更因环境破坏，过度采挖，致使野生资源濒临绝种。研究铁皮石斛的代谢途径与调控，有助于更好地开发利用铁皮石斛的市场价值。苯丙烷类化合物生物代谢途径是一条与碳循环有关的最主要的次生代谢途径之一。在植物中，该途径的各种分支途径可以产生许多天然产物如黄酮、类黄酮、木质素、色素、芪类、酚酸类化合物等[2]。作为该代谢途径中关键限速酶之一的4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-Coumarate:CoenzymeALigase4CL），控制着苯丙烷类化合物代谢途径向不同的方向进行，处在总途径向各分支途径的转折

6、点。前人的研究结果表明，4CL基因在植物与环境的相互作用中也起着重要作用。经研究证实，除了多糖外，铁皮石斛中的酮类、芪类物质也具有重要的药理活性，如β-紫罗兰酮具有抑制肿瘤生长的作用[3]；芪类化合物是一种抗菌的植物抗毒素，具抑菌抗氧化抗肿瘤等多种生物活性[4]，LiYan等[5,6]曾从铁皮石斛茎中分离得到27个芪类及其衍生物。因此，研究铁皮石斛中的4CL基因，对解析铁皮石斛次生物质代谢调控及人类健康事业具有重要意义。本文主要研究铁皮石斛4CL基因的克隆及其序列分析。以铁皮石斛为实验材料，参考其它植物4CL基因的序列，利用DNAstar软件

7、设计简并引物，克隆铁皮石斛4CL基因cDNA片段，利用RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术获得该基因的3’和5’末端序列，进而获得该基因的全长cDNA。同时利用GenBank数据库和Blast软件等对所得序列进行分析，为进一步研究4-香豆酸：CoA连接酶在石斛次生代谢途径中的作用提供理论依据。91.材料与方法1.1试验材料铁皮石斛茎叶，取自安徽农业大学生命科学学院。1.2试验试剂RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司），Taq酶、PMD18-Tvector、dNTPs和RACEcDNAAmplificati

8、onKit（均购自TAKARA公司），EscherichiacoliDH5α（由实验室制取培养），柱式胶回收纯化试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）；引物合成