柞蚕免疫相关基因的鉴定与表达分析

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2、阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论文全文数据库》，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)。学位论文作者签名：逍越每签字日期：功叫年6月7日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通信地址：指导教师签字日期电话：邮编：万方数据摘要作为无脊椎动物，昆虫缺乏获得性免疫，丰要依赖发达的先天性免疫系统来抵御病原微牛物的入侵。先天性免疫系统由细胞免疫和体液免疫两部分组成，二者协同作用参与宿丰对病原物的吞噬、集结、包囊和黑

3、化反应。细胞免疫是指由血细胞介导的吞噬、节结形成和包囊等过程，体液免疫包括诱导抗菌肽产牛的Toll和Imd两条信号通路，以及多酚氧化酶原(prophenoloxidase，PPO)激活的级联反应。柞蚕足一种重要的野牛绢丝昆虫，属于鳞翅日、大蚕蛾科、柞蚕属，主要分布在中国、印度和韩国。柞蚕蛹含有人体伞部必需的氨基酸，作为营养丰富的高质量昆虫食品，除了作为纺织工业原料利用外，还有很高的药用和食用等经济价值。本文采用抑制消减杂交的方法构建大肠杆菌刺激的柞蚕蛹cDNA文库，测序获得了400条EST序列，并进行了基因注释和功能分类，同时利用半定量PC

4、R和定量PCR技术，对免疫相关基因进行了功能验证，实验结果为进’步探明柞蚕先天免疫机制以及利用牛物技术提高柞蚕的抗病性提供了参考。本文的研究结果主要包括以下二：；三方面：1、抑制消减杂交cDNA文库的构建为获得柞蚕免疫相关基因，采用抑制性消减杂交技术构建J，大肠杆菌刺激后的柞蚕蛹脂肪体消减eDNA文库，并随机挑取400个cDNA克隆进行了单向测序，共获得有效EST序列328个，通过在线网站Blastn比对和通过CAP3软件进行序列拼接，注释得到202个unigenes并分成九组：50个免疫应答相关基因(25％)，三个细胞骨架相关基因(1％)

5、，八个细胞牛殖与凋亡相关基因(4％)，五个能量代谢相关基因(2％)，五个转运相关基因(2％)，40个物质代谢相关基因(20％)，10个胁迫应答相关基因(5％)，四个转录与翻译调控相关基因(2％)，77个未知蛋白(39％)。另外，通过序列拼接，得到抗菌肽．4和溶菌酶的全长cDNA，氨基酸比对和进化分析显示它们和大蚕蛾科昆虫较高的同源性和较近的亲缘关系。2、免疫相关基因的表达分析为了检测柞蚕免疫相关基因的表达情况，搜集大肠杆菌刺激柞蚕蛹不同时间的脂肪体组织，通过半定量PCR和荧光定量PCR技术检测免疫基因表达水平。对于模式识别受体，肽聚糖识别蛋

6、白和B一1，3一葡聚糖识别蛋白在0．5小时大量表达，肽聚糖识别蛋白A在3小时上调超过80倍，类免疫球蛋白也在三小时上调超过三倍，而凝集素A和球蛋白在外源物刺激前也自‘一定量的表达。抗菌肽蛋白是先天免疫的重要组成部分，随机挑选的八个抗菌肽基因都能被大肠杆菌诱导并持续表达；attacin一1在三小时达到最大表达量，抗菌肽．和溶菌酶在12小时表达量最大，lebocin2蛋白在24小时诱导表达达到顶峰。此外，微卵黄原蛋白、多吧脱羧酶和谷胱甘肽转移酶theta在O．5小时诱导表达量超过两倍，蛋白酶抑制剂5、6、8在三小时处表达明显增加，万方数据蛋白酶

7、抑制剂3，铭氨酸蛋白酶1和蛋。白酶抑制剂4在24小时明显卜-调。3、柞蚕Apolipophorin—III皋因的克隆与表达分析通过RACE—PCR方法克隆获得了柞蚕Apolipophorin—IIl基因全长序列：包括由40bp的5’端非编码区(5’UTR)、86个bp组成的3’端非编码区(3’UTR)，以及由561个核苷酸组成的ORF(开放阅读框)编码186个氨基酸，包含一个Apolipophorin—III前体结构域，分子量人小为2lkDa和等电点为7．96。与烟草天蛾、家蚕和埃及伊蚊的氨基酸序列一致性分别为68％、59％和23％。进化树

8、分析显示与蚕蛾科昆虫亲缘关系较近。通过实时定量PCR方法检测Apolipophorin—III基因在四个不同发育时期都有表达，并在五龄幼虫部分组织表达；分别注射病原物后，在不同时