子痫前期外周血免疫相关基因的差异表达

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1、子痫前期外周血免疫相关基因的差异表达【关键词】子痫前期差异表达寡核苷酸序列分析基因免疫　【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferentialexpressionofimmunity-relatedgenesinperipheralbloodleucocytesbetpsiaandnormalpregnancycases,andtoexplorethepathogenesisofpreeclampsia.MethodThedifferentialgeneexpressionfilesof4severepreecla

2、mpsiaand4normalpregnancycasesmunity-relatedgenes.Results33differentiallyexpressedimmunity-relatedgeneshadtheconcordanceinatleast2casesamongtotal21000genes.23genesmunity-relatedgenesinperipheralleucocytesfrompreeclampsiamayberesponsibleforthemolecularmechanismofpreeclampsia.　　【Key

3、psiaDifferentialexpressionOligonucleotidearraysequenceanalysisGeneImmunity　　子痫前期是一种常见的妊娠并发症，是导致孕产妇和围生儿死亡的重要原因之一，其病因及发病机制至今仍未完全阐明。已有的大量研究表明免疫因素在子痫前期的发病中起重要作用。自2007年7月至2008年7月应用基因微阵列技术对子痫前期外周血白细胞基因进行平行、大规模、高通量的分析，了解子痫前期患者外周血免疫相关基因表达的变化，以寻找差异基因与子痫前期发病机制之间可能的内在联系。现报告如下。　　1对象与方法　　1.1研

4、究对象　　选择重度子痫前期患者4例为研究对象，子痫前期的诊断标准依照乐杰主编《妇产科学》第六版的标准。选择4例同期正常妊娠妇女为对照组，无妊娠期高血压病史及家族史。两组孕妇均为中国汉族妇女，单胎初孕妇，年龄、孕周、职业分布均衡，体重指数接近，无糖尿病、原发性高血压病史，无风湿、类风湿、红斑狼疮等自身免疫相关疾病，排除心、肝、肾及甲状腺疾病。　　1.2研究方法　　1.2.1外周血白细胞的分离　　提取病例组及对照组肘静脉新鲜全血15ml，立即用EDTA抗凝。离心弃去血浆后再加淋巴分离液，移液器收集界面上的白细胞层，离心弃上清可见白色的沉淀，加入Trizol试

5、剂，用移液器充分抽打、混匀，直到形成清亮不粘稠的液体。　　1.2.2细胞总RNA的抽提与鉴定　　Trizol法抽提细胞总RNA，样品经紫外分光光度计检测A230、A260、A280值，甲醛变性胶电泳检测28S、18S条带变化，鉴定样品质量是否符合表达谱芯片的实验要求。　　1.2.3对样品RNA进行荧光标记　　双链cDNA的合成与纯化，以cDNA为模板用随机引物和Klenow酶进行DNA链的标记，并在DNA链延伸过程中掺入荧光素。　　1.2.4杂交与清洗　　将标记的DNA溶于杂交液中42℃杂交过夜，清洗后玻片甩干即可用于扫描。　　1.2.5信号扫描和分析　

6、　芯片用ScanArrayExpress双通道激光扫描仪进行扫描，分别得到子痫前期外周血cDNA的Cy5图像文件和正常妊娠外周血的Cy3图像文件。采用GenePixPro4.0图像分析软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后以差异为两倍的标准来确定差异表达基因。比值>2.0表示子痫前期外周血基因表达水平高于正常妊娠，比值<0.5则显示子痫前期外周血基因表达水平低于正常妊娠。　　2结果　　2.1总RNA抽提与鉴定结果　　样本的总RNA经紫外分光A230、A260、A280测定，甲醛变性胶电

7、泳检验RNA样品质量符合表达谱芯片实验要求。OD260/OD280值为1.714～1.965，均介于1.7～2.1之间。结果显示总RNA无降解，28S、18S条带清晰，28S比18S的亮度接近2∶1，提示得到高纯化的总RNA。　　2.2基因表达谱芯片杂交结果　　图1和图2均为Cy5荧光标记的子痫前期外周血白细胞cDNA杂交扫描图像与Cy3荧光标记的正常妊娠外周血白细胞cDNA杂交扫描图像的叠加图像。在图像中，如果Cy3信号较强，该点呈绿色，表示该基因呈下调趋势；如果Cy5信号较强，该点呈红色，表示该基因呈上调趋势。在两种外周血中表达水平相当的显黄色，而均

8、不表达的则为无色。图1显示肿瘤坏死因子（TNF-α）在子痫前期外周血表达增高，C