猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41团体标准T/CVMAX8—2019猪圆环病毒3型荧光PCR检测方法Real-timeRT-PCRassayfordetectionofporcinecircovirus3（征求意见稿）CVMA中国兽医协会2019-XX-XX发布2019-XX-XX实施中国兽医协会发布T/CVMAX8-2019前言本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草。本标准不涉及有关专利。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：青岛立见诊断技术发展中心、中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所。本标准起草人：张志、李阳、孙学强、刘爽、徐烽晔、宫枫举、官丽娟、邵钰、李翠翠、李晓成

2、、蒋文明、于晓慧、王琳、周晓翠、王团结。CVMA中国兽医协会-1-T/CVMAX8-2019猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测的技术要求。本标准适用于猪圆环病毒3型的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1PCV3：猪圆环病毒3型（porcinecircovirus3）3.2实时荧

3、光PCR：实时荧光反转录聚合酶链式反应（Real-timePCR）3.3Ct（或Cp）值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Thresholdcycle）3.4FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein）4仪器设备4.1荧光PCR检测仪。4.2台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达CVMA12000r/min以上。4.3普通冰箱中国兽医协会：2℃~8℃。4.4普通冰柜：-20℃以下。4.5超低温冰箱：可控温至-70℃以下。4.6微量移液器：0.1μL~2.5μL、1μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL，并配备与移液器匹配的吸头

4、。4.7高压灭菌锅。5试剂和耗材5.1试剂5.1.1DNA提取试剂盒5.1.2PCV3检测引物和Taqman荧光探针，序列如下：上游引物qPCV3-F：5’-CGGAGACGTCGGGAAATCTG-3’；-2-T/CVMAX8-2019下游引物qPCV3-R：5’-CCCCCGTGGCTTGAAATAC-3’；荧光探针qPCV3-Probe：5’FAM-CACCCCGCAAAAATCACGCAAACC-3'BHQ1。5.1.3阳性对照：体外转录的PCV3阳性质粒DNA。5.1.4阴性对照：为已知PCV3阴性的猪组织悬液。5.2耗材5.2.11.5mL离心管。5.2.20.2mLPCR薄壁

5、管或八联管。5.2.310-200μL带滤芯吸头。6样品的采集、保存和运输6.1样品的采集取猪抗凝全血、扁桃体、脾脏、淋巴结等主要脏器适量（5g~10g）装入灭菌15mL样品管中，编号，备用。6.2样品的保存上述采集的样品可立即用于检测，不能立即检测的样品，在2℃~8℃条件下不超过24h，-20℃可以短期保存，-70℃以下可以长期保存。6.3样品的运输样品的运输必须采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。7实时荧光PCR操作程序7.1样品DNA提取用商品化的DNA提取试剂盒提取样品的DNA，备用。提取的DNA应立即进行实时荧光PCR扩增，如在4℃保存，不宜超过8h，如需长期保存

6、，应放置在-20℃或-70℃冰箱中。7.2反应体系的配置在反应配置区进行。每个检测反应体系使用18μL的实时荧光RT-PCR反应液，分别加入制备的RNA溶液2μL，使每管总体积达到20μL，编号，拧紧管盖后，500r/min离心30s。7.3实时荧光PCR反应CVMA在检中国兽医协会测区进行。在荧光PCR仪上选用FAM通道，设置如下反应参数：95℃变性3min，然后40个循环（95℃8s，60℃15s），60℃采集信号。8结果判定8.1阈值设定阈值设定原则根据不同的荧光PCR仪的噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。8.2质量控制读取每个样品的Ct值，标准阳性对照

7、有特异性扩增曲线而且Ct值≤30，标准阴性对照无特异性扩增曲线，说明质控合格。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。8.3结果描述及判定8.3.1被检样品有特异性扩增曲线，而且Ct值≤35，判定为PCV3核酸阳性。-3-T/CVMAX8-20198.3.2被检样品无特异性扩增曲线或者Ct值>37，判定为PCV3核酸阴性。8.3.3被检样品有特异性扩增曲线，而且35