DB41∕T 1525-2018 猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法

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1、ICS65.020.30B41DB41河南省地方标准DB41/T1525—2018猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法2018-01-03发布2018-04-03实施河南省地方标准公共服务平台河南省质量技术监督局发布DB41/T1525—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，驻马店市动物疫病预防控制中心，平顶山市动物疫病预防控制中心，商丘市动物疫病预防控制中心，国家食品药品监管总局。本标准主要起草人：班付国、闫若潜、王翠、谢彩华、王淑娟、

2、王东方、朱前磊。本标准参加起草人：赵雪丽、王华俊、孙素芳、郭育培、陶顺启、刘敏、苑述友、苗连叶、杨海波、王李辉、王一、王磊、钱勇。河南省地方标准公共服务平台IDB41/T1525—2018猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）实时荧光PCR检测的试剂和仪器设备，样品采集、处理、存放及运输，操作方法及结果判定。本标准适用于对疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等组织样品及血液样品中病毒核酸的检测。2试剂和仪器设备除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。水为灭菌双蒸水

3、或超纯水。2.1试剂2.1.1组织悬液、消化液Ⅰ、TE缓冲液（见附录A），以上试剂常温保存。2.1.2酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)、0.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）、1×核酸电泳缓冲液、阿氏液（见附录A），以上试剂4℃保存。2.1.3消化液Ⅱ、阳性对照、阴性对照（见附录A），置-20℃保存。2.1.4PCV2实时荧光PCR检测用上、下游引物及探针序列参见附录B。2.2仪器设备实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12000×g以上），二级生物安全柜，恒温水浴锅，2℃～8℃冰箱，－70℃冰箱，组织

4、匀浆器或研钵，单道微量移液器（0.1µL～0.25µL；0.5µL～10µL；2µL～20µL；20µL～200µL；100µL～1000µL），真空干燥器（非必备）。3样品的采集、处理、存放及运输3.1样品的采集及处理采集疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等靶组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约0.5g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，然后将悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清转入新的无菌Eppendo

5、rf管中，编号备用。3.2血清和抗凝血用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用；用无菌注射器先吸入抗凝剂（阿氏液）2mL～3mL，再自耳缘静脉或前腔静脉采集等量血液，快速混匀后转入无菌Eppendorf管中，编号备用。3.3存放与运送河南省地方标准公共服务平台1DB41/T1525—2018采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。4操作方法4.

6、1样品DNA的提取4.1.1取1.5mL无菌离心管，于各管中分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各100µL，再加入500µL消化液Ⅰ和10µL消化液Ⅱ，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；置55℃水浴30min～1h。4.1.2分别加入500µL酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，于4℃条件下12000r/min离心10min。4.1.3分别吸取离心后的上清液转移至新的1.5mL无菌离心管中（注意不要碰到中间层），加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，室温放置15min。4.1.44℃条件下12000r/min离心15min（离

7、心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体；不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。加入700µL75%乙醇，轻轻混匀。4.1.54℃条件下12000r/min离心5min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体；不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。4.1.64℃条件下12000r/min离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不应触及沉淀，真空抽干3min～5min或室温干燥10

8、min。4.1.7加入10µLTE缓冲液，轻轻混匀，溶解DNA，2000r/min离心5s，置-20℃冻存备用。4.1.8DNA的制备可采用4.1.1～4.1.7提取方法，也可采用商品化的试剂盒提取。4.2实时荧光PCR扩增4.2.1实时荧光PCR