DB21T 2327-2014 猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法

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1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2327—2014猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法MethodofrealtimefluozescentPCRforthedetectionofporcinecircovirustype22014-07-05发布2014-09-05实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2327—2014前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草

2、人：于学武、顾贵波、赵晓彤、崔基贤、陈瑶、魏澍、马建山、王竹、申贯男、赵凤菊、李璐、李晓楠、于丹、王海丰IDB21/T2327—2014猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2，PCV2）实时荧光PCR检测方法的实验技术要求。本标准适用于PCV2的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液、排泄物和细胞培养物中PCV2核酸的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注

3、日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。PCV2：猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2）HSTaq酶：热启动TaqDNA聚合酶（HSTaqDNApolymerase）Ct值：达到阈值的循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）实时荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（realtimefluozescentquantitativepolymerasechainre

4、action）PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）4原理根据PCV2基因特定序列的保守片段，合成一对特异性引物和一条特异性探针。荧光探针的5’端标记FAM荧光素，3’端标记TAMRA荧光素，3’端的淬灭基团在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号。但在扩增时，由于Taq酶的5’→3’的外切活性，在延伸到荧光探针时，将探针切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可通过检测荧光信号对核酸进行检测。5仪器和器材5.1仪器主要仪器有分析天平、高速离心机、荧光PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、

5、可调移液器（最大量程为2μL，20μL，200μL，1000μL）。1DB21/T2327—20145.2器材主要器材有组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、PCR八联排管或96孔板、吸头（10μL，200μL，1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。6试剂和材料6.1DNAzol®Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4～8℃保存。TM6.2PremixExTaq（ProbeqPCR）：TaqMan探针法进行RealtimePCR反应的专用试剂，为PCRBuffer、dNTP、RNaseH和HSTaq酶

6、的预混液，于-20℃长期保存，融化后于4～8℃保存。6.3PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.4无水乙醇：-20℃预冷。6.575%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。6.6阴性对照：灭菌双蒸水。6.7阳性对照：PCV2细胞培养物。注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放和运送7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121（±2）℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干热

7、灭菌2h。7.1.3内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。取100mg左右待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000g离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.4血液样品的采集与处理用无菌注射器采集血液，注入含1/104%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。7.1.5粪便的采集与前处理2DB21/T2327—2014用药匙采取猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS，混匀，1000

8、g离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.