EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立-论文.pdf

《EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立-论文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、生物技术通报·技术与方法·BIoTECHNoLoGYBULLETIN2O14年第6期EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立蔡晔饶品彬吴海港姜永厚(浙江理工大学生命科学学院，杭州310018)摘要：根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)0RF4基因序列设计一对特异性引物，通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因，并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18．T载体中，构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR，建立了PCV2DNA的标准曲线，并进行熔解曲线分析。结果显示：建立的EvaGreen实时荧光定量

2、PCR特异性强，与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应；灵敏度高，最高可检测到10拷贝／的病毒量；重复性好，3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2．5％；对ll8份临床样品进行检测，阳性样品25份，阳性率为21．2％，检测结果与普通PCR相符率为99．2％，其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性，普通PCR检测为阴性。结果表明，建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点，可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。关键词：猪圆环病毒2型EvaGreen实时荧光定量PCR检测Development

3、ofEvaGreenReal—timeFluorescenceQuantitativePolymeraseChainReactiontoDetectPorcineCircovirusType2CaiYeRaoPinbinWuHaigangJiangYonghou(CollegeofLifeScience，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou310018)Abstract：AccordingtogenomesequencesofORF4ofporcineeircovirustype2(PCV2)publishedinGen

4、Bank，apairofprimerswasdesigned．TheORF4genewasamplifiedwithtraditionalPCR．ThePCRproductwasclonedintopMD18-Tvectorandsequencedtoconstructpositiverecombinantplasmid．TherecombinantplasmidwasusedastemplateforEvaGreenreal-timePCRtogeneratestandardcurveandmeltcurve．TheresultsshowedthatE

5、vaGreenreal-timePCRinthepresentstudywashighlyspecificwhileusedtodetectothernontargetviruses，anditssensitivitywasprovedtobe10copies／~tLandreproducibilityforbothintra—assayandinter—assaywerelessthan2．5％．Thentheestablishedmeth0dwasutilizedtotest118clinicalsamples．Theresultindicatedt

6、hatthePCV2positiveratewas25／118，whichwas99．2％consistentwiththatofconventionalPCRtests，exceptonesamplethatwaspositiveforPCV2byreal-timePCRbutnegativebyconventionalPCR．Thus，thismethodinthecurrentstudyshowedthecharacteristicsofspecificity，sensitivity，reproducibilityandsimpleoperatio

7、n，whichcouldbeusedinsubclinicaldiagnosisandepidemiologiealinvestigationofPCV2．Keywords：Porcinecircovirustype2EvaGreenReal—timePCRDetection猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2，PC—DC)、猪皮炎与肾病综合征(Porcinedermatitisandv2)是近年来发现的一种重要的猪病病原，与在各地nephropathysyndrome，PDNS)、仔猪先天性震颤广泛流行的断奶仔猪多系统衰竭综合征

8、(Postweaning(Congenitaltremor，CT)及猪繁殖系统障