evagreen多重实时荧光定量pcr同时检测多种猪病毒研究

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1、曲弘理≯大学硕士学位论文EvaGreen多重实时荧光定量PCR同时检测多种猪病毒研究作者姓名饶品彬学科专业生物化学与分子生物学指导老师姜永厚所在学院生命科学学院提交日期2014年3月12日中国杭州ZHE儿ANGSCI．TECHUNIVERSITYMASTERDISSERTATl0NSimultaneousdetectionofsixswinevirusesbyanEvaGreenmultiplexreal-timePCRPinbinRaoDirectedbyAssoc．Prof．YonghouJiangCollegeo

2、fLifeSciences，ZhejiangSci-TechUniversityMar,2014HANGZHOU，CHINA分类号：UDC：密级：EvaGreen多重实时荧光定量PCR同时检测多种猪病毒研究论文答辩日期2014-3．6答辩委员会主席商晗武教授论文评阅人盲审李恭楚副教授答辩委员会成员商晗武教授刘小川教授梁宗锁教授丁先锋副教授徐涛副教授浙江理工大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过

3、的研究成果，也不包含为获得浙江理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：七笼品书日期：臼切，垆年；月，，日浙江理工大学学位论文版权使用授权书I删1㈣278Y255本学位论文作者完全了解逝江理王太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江理王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位

4、论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：乞髦品社；签名日期：洌悔三月t／日导师签名：铆导师签名：獬签名目期：瓣弓月f瑁课题来源浙江省自然科学基金(Y3090166)浙江理工大学硕士学位论文EvaGreen多重实时荧光定莓PCR同时稔测多种猪病毒研究摘要猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、猪圆环病毒1I型(Porcinecircovirus2，PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)、猪瘟病毒(Cl

5、assicalswinefevervirus，CSFV)、日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)这几种病毒引起的疾病在临床上常呈现出相似的呼吸和繁殖障碍症状，并且常常呈混合感染，给养猪业造成重大损失。依据常规病原学检测及临床病理变化很难作出准确的判断，尤其是多种病原混合感染时，难以进行早期快速检测，容易产生误判错判，因此建立～种快速准确能同时对多种病原进行检测的方法对疾病的诊断和防治具有重要意义，而兼有多重PCR和实时荧光P

6、CR优点的多重实时荧光PCR方法可以应用于多病原混合感染的快速检测。多重实时荧光PCR包括荧光探针和荧光染料两类。探针多重实时荧光PCR的特异性较好，但由于受到实时荧光PCR仪器检测通道限制，无法同时进行四种以上的病原检测，而且设计多条探针会增加总成本。荧光染料多重实时荧光PCR是通过识别扩增产物熔解峰以达到检测目的，不受检测通道限制。荧光染料EvaGreen相比SYBRGreenI具有更高敏感性和稳定性，而且在多重检测中克服了对扩增子的结合偏爱性，因此EvaGreen更适合于多重实时荧光PCR，基于本研究建立的Eva

7、Green多重实时荧光PCR方法，能够快速有效的同时检测六种猪病毒，并具有简便易行、成本较低等优点。基于最终需要建立EvaGreen多重实时荧光PCR方法，本研究首先建立了六种猪病毒EvaGreen单重实时荧光PCR检测方法，其中六种病毒经实时荧光PCR扩增后产生的熔解峰能够有效区分，是各病毒单重实时荧光PCR优化的前提条件，通过选定的引物同时对目的核酸序列和非目的核酸序列扩增来检测特异性，结果显示PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、JEV和PRV均无非特异性扩增：并进行六种病毒的灵敏度检测，其中PCV2和CSFV

8、的检测极限可达10copies／lxl，PRV和JEV的检测极限可达25copies／Ittl，PPV和PRRSV的检测极限可达50copies4d；分别选取各病毒的3个浓度进行批内和批间重复试验，变异系数均在5％以内，显示各病毒单重实时荧光PCR重复性良好。在六种猪病毒EvaGreen单重实时荧光PCR优化完成的基础上，建立一个