EVaGreen实时荧光PCR法检测人类双埃可病毒.pdf

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1、1462中国卫生检验杂志2013年6月第23卷第6期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology，Jun2013；Vol23No6【微生物检测方法】EVaGreen实时荧光PCR法检测人类双埃可病毒曾华书，周海涛，候红斌，陈润莉，张勇，赖植发(广东省深圳市福田区疾病预防控制中心检验科，广东深圳518040)[摘要】目的：构建实时荧光PCR法以测定人类双埃可病毒RNA。方法：通过相关资料自行设计合成人类双埃可病毒引物，将病毒RNA进行反转录之后，进行基于EVaGreen染料的实时荧光定量(Real—time)PCR扩增，通过高分

2、辨率溶解曲线、核酸电泳及产物测序验证PCR结果。结果：对该病毒保守区约260BP片段扩增成功，测序证实为人双埃可病毒序列，建立了该病毒EVaGreen实时荧光PCR检测方法。结论：为人类双埃可病毒的检测提供了一种快速简便的方法。[关键词]实时荧光聚合酶链反应；人双埃可病毒；高分辨率熔解曲线[中图分类号]R446．5[文献标识码]A[文章编号]1004—8685(2013)06—1462—03Detectionofhumanparechoviruswithreal——timeEVaGreenRT——PCRassayZENGHUA—shu，ZHOUHai—tao，HOU

3、Hong—bin，CHENRun—li，ZHANG，，ZHI一如(FutianCenterforDiseaseControlandPrevention，Shenzhen518040，China)lAbstractlobjective：Toestablishthereal—timeR_T—PCRassayfordeterminationofhumanparechovirusRNA．Methods：Onepairofprimersweredesignedandsynthesizedaccordingtoreferencespublishedforhumanparecho

4、virus．afterRNAwasreverse—transcribed，thecDNAwasamplifiedbyEVaGreendye—basedfluorescentRe—al—timePCR，thenhigh—resolutionmeltingcurve，ranagarosegelselectrophoresisandsequencingweredonewiththeproducts．Results：Conservedregionofthevirusabout260BPwasamplifiedintheexperimentsandconfirmedashum

5、anparechovirussequence．Detectionmethodoftheviruswasbuilt．Conelusion：Itprovidesanewmethodforsimpleandquickdetectionofhumanparechovirus．[Keywords]Real—timeRT—PCR；Humanparechovirus；High—resolutionmeltingcurve人双埃可病毒(HumanPareehovirus，HPeV)属于小选取2011年5月一2011年1O月间，深圳市北大医RNA病毒科(Picornaviridae)

6、，双埃可病毒属(Pareehovir—院儿科采集的6个月～6岁间儿童疑似病毒性腹泻样品US)的一种单股正链RNA病毒，全长约7300bp。迄今为若干，一80℃保存。止，国外应用血清学和遗传学的方法已经发现至少有161．2试剂、仪器个HPeV(血清)类型(HPeV1—14)。HPeV感染后引HighPureViralRNAKit(Roche)；PrimeScriptRTre—起的临床症状与人肠道病毒(Humanenteroviruses，HEV)agentKitWithgDNAEraser(PerfectRealTime)、Loading感染后的临床症状相类似，主要引

7、起婴幼儿胃肠道、呼Buffer、150bpDNALadderMarker、5×TBE均购自宝生物吸道相对温和的症状，但是诸如脑炎、心肌炎、脓毒症、工程(大连)有限公司；Agarose—I—H(AMRESCO)；Sso—弛缓性麻痹等致命性症状也有报道-z，因而该病已引FastEvaGreenSupermix、GelRed10000×inDMSO、起一些机构的关注，并进行了相关的监测。CFX96Real—timeSystem、核酸蛋白电泳系统、凝胶成像目前国内实验室关于HPeV的研究与检测较少，也系统均购自BIO—RAD公司。没有系统成熟的商品化检测试剂，本实验通过