猪gapdh基因实时荧光定量pcr方法的建立

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1、西南农业学报2010年23卷4期1282SouthwestChinaJournalofAculturalSciencesVo1．23N0．4文章编号：1001—4829(2010)04—1282—04猪GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立韩建强，许文花，高斌(1．玉溪农业职业技术学院动物科学系，云南玉溪653106；2．云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201：3．云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201)摘要：根据GenBank上猪GAPDH基因的序列设计并合成一对引物，采用SYBRGreenI染

2、料建立了Real—timePCR方法。以阳性重组质粒为标准品，建立了标准曲线，并进行了融解曲线分析。结果表明，所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点。研究结果为GAPDH作为内参基因用于猪相关基因定量表达分析奠定了基础。关键词：猪；GAPDH基因；Rea1．timePCR；内参基因中图分类号：$858．28文献标识码：ADevelopmentofReal-timePCRAssayforSwineGAPDHGeneHANJian—qiang。XUWen—hua，GAOBin’(1．DepartmentofA

3、nimalScience，YuxiAculturalVocation·TechnicalCollege，YunnanYuxi653106，China；2．CollegeofAnimalSci—enceandTechnology，YunnanAculturalUniversity，YunnanKunming650201，China；3．CortegeofFoodScienceandTechnology，Yun·naIlAculturalUniversity，YunnanKunming650201，China)Abstract：

4、AccordingtotheswineGAPDHgenesequencesavailableinGenBank，apairofprimerswasdesignedforestablishingaSYBRGreen1quantitativereal-timePCRmethodforswineGAPDHgeneofswine．ToestablishthestandardCUI'Ye．theplasmidsservedasastand-ard．Theanaly8isofmeltingcurvewasalsocarriedout．T

5、heresultsshowedthatthereal—timePCRmethodestablishedinthestudyhadad—vantagesofrapid，high—throughput，widelinearrangeandsoedreproducibility．TheresultsofthisstudycouldprovidebasisforGAPDHusedasareferencegenetoanalyzetheswinegenequantitatively．Keywords：Swine；GAPDHgene；R

6、eal—timePCR；Referencegene实时荧光定量PCR(real-timePCR)是20世纪是在不同个体及组织细胞中均稳定表达的持家基9O年代发展起来的一种准确、快速的核酸定量分析因，常用的内参基因主要包括B—actin、28SrRNA、技术⋯，是定量研究基因表达水平最为有用的方法18SrRNA、GAPDH、TBP和beta-2．microglobulin等。之一“J。它分为绝对定量和相对定量。绝对定量其中，GAPDH基因，即3一磷酸甘油醛脱氢酶基因PCR是用标准曲线来检测未知样本的精确拷贝数；(Glycera

7、ldehyde一3一phosphatedehydrogenase)，为参与相对定量PCR是检测未知样本问基因表达的差异。糖酵解的一种关键酶，是最为常用的内参基因之一。在相对定量检测中，为了比较不同样本mRNA表达本研究即根据GenBank中猪GAPDH基因现有的相量水平，必须是不同样品之间起始细胞数目相同、关序列，建立了基于SYBRGreenI染料技术的猪RNA提取效率相同、且目的基因的扩增效率相同，GAPDHreal—timePCR方法，从而为GAPDH基因作才能保证结果的可比性。但实际上这些条件不可能为内参基因，在利用r

8、ea1．timePCR对猪功能基因表同时得到满足，因而需要通过选择一个能在不同组达水平以及对病原基因的定量研究提供有用的方法织细胞稳定表达的基因作为内参，与目的基因同时学依据。检测，以确定目的基因表达量。。。内参基因往往1材料与方法收稿日期：2009—12—24作者简介：韩建强(1973一