猪圆环病毒2型lamp检测方法建立和不同基因型感染性克隆的体外拯救

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1、Loop．mediatedisothermalamplificationfordetectionofporcinecircovirustype2andidentificationofrescuedvirusesfrominfectiousclonesoftwogenogroupsinvitroThesissubmittedt013eslsSUbmltteQngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—M

2、asterofAgronomHanSi(CollegeofAnimalScienceandTechnology)Supervisor：WangJinbaoQingdao．ChinaJune，2012独创性声明IUllFllllllElllllllllllllfillIMIIllllIY2333085本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机

3、构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：椒时间：励年参月妒关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生躲韩彳红慨沁肝乡月必日导师签名：互垂寥时间：年月

4、日猪圆环病毒2型LAMP检测方法建立和不同基因型感染性克隆的体外拯救摘要猪圆环病毒(Porcinecircovirus)是无囊膜单股负链环状DNA病毒，于1974年首次从猪肾传代细胞(PKl5)中分离得到，根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，分为PCVl和PCV2两型。PCVl无致病性，PCV2是危害世界养猪业发展，引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)、母猪繁殖障碍等多种疾病的重要病原之一。PCV2感染猪体后，侵害其免疫系统，使机体抵抗力

5、下降而引起继发感染和混合感染，造成更严重的损失。本研究利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了一种新的检测PCV2核酸的方法，扩充了实验室检测抗原的方式，由于LAMP检测方法摆脱了昂贵仪器的束缚，适合于条件受到限制的基层临床诊断。此外，本研究根据PCV2型特异性基序Cap蛋白86．91位氨基酸序列，在对实验室保存的菌株进行筛选，得到连有PCV2a和PCV2b两型毒株的质粒，酶切之后环化PCV全长，转染PKl5细胞，并成功拯救出两型病毒。得到可用的感染性克隆后，便可以改造基因序列从而改变决定分型的6

6、个氨基酸残基，为以后开展的型特异性序列与病毒致病力的关系研究打下了坚实基础。以PCV2ORF2序列作为靶基因，用PrimerExplorerV4设计出4条LAMP引物。通过对体系各组分的优化建立最佳体系，确定63℃为最适反应温度，1h以内就能完成对核酸的扩增。制备出梯度质粒模板，与PCR方法在灵敏度试验中进行比较。LAMP方法最小检出量达到接近1拷贝，敏感性是之前实验室所用PCR方法的一万倍。并且，相同条件下，与PCVl、PRV或PPV的DNA均无交叉反应现象。在临床病料检测中同样有着良好的表现。

7、在结果判定方面，LAMP不光可借助琼脂糖凝胶电泳呈现出特有的阶梯状条带，也可以向扩增产物中添加SYBRGreenI核酸染料，通过肉眼观察颜色变化。综上，LAMP在对PCV2抗原检测中，不论是检测时间、条件要求、灵敏度都要优于PCR方法。对实验室保存的、之前测序过的、连有PCV2DNA全长的重组质粒的菌种进行筛选，PCV2Cap蛋白86．9l位氨基酸序列若为TNKISl分属PCV2a型，若为SNPRSV则为PCV2b型。摇菌再送测序，确定选择D1株(HMl42897)为PCV2a代表，SDl株(DQ

8、346683)为PCV2b代表。PCV2基因序列中有唯一的SacII酶切位点，当时扩增PCV2全长的上下游引物便设立在此。因此以SacII酶切重组质粒pMDl8．T-D1和pMDl8．T-SDl，先得到PCV2a和PCV2b的线性DNA全长，切胶回收后将其环化，使用环化DNA转染PKl5细胞，收毒作为PO代。在P4、P9代两型病毒液的IFA检测中，分别都可见荧光，且明显P9代要比P4代明亮。对几代病毒液的PCR检测，也可见随着代数增加，条带亮度逐渐变亮。以上都证明了病毒复制的存在。