猪圆环病毒2型间接elisa检测方法的建立及抗orf2蛋白单克隆抗体的制备

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1、山东农业大学硕士学位论文猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法的建立及抗ORF2蛋白单克隆抗体的制备姓名：姚永红申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：周恩民20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要猪圆坏病毒2型(Porcinecircovirus2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征的病原，属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。断奶仔猪多系统衰竭综合征最早于1991年在加拿大断奶仔猪中被发现，此后在世界其他国家也相继被检出。该病不但可以引起断奶仔猪衰竭、死亡，还与先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征和呼吸道疾病综合征有关。更为严重的是，PCV2感染所引起的猪免疫抑制

2、会直接导致其他传染病免疫的失败，并引起其他病原的继发感染，造成的间接损失难以估算。PCV2无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因全长为1767bp或1768bp，共有包括ORFl和ORF2在内的11个开放阅读框。其中，ORF2全长702bp，编码由234个氨基酸构成的衣壳蛋白Cap。Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白，具有较好的免疫原性，是检测该病毒特异性抗体的理想抗原。本研究设计并扩增了去掉N端信号肽的516bp大小的ORF2片段，成功表达并纯化，以此作为包被抗原，建立了检测临床抗PCV2抗体的间接ELISA检测方法，同时以此作为免疫原，利用淋巴细胞杂交瘤技术筛选特异性针对O

3、RF2蛋白的单克隆抗体(Monoclonalantibodies，MAb)，为PCV2的进一步研究和诊断提供技术手段。研究主要包括以下内容：1、PCV2ORF2基因片段的克隆与原核表达本研究扩增了去掉N端信号肽后516bp大小的ORF2片段，并在大肠杆菌原核表达系统E．coliRosetta中成功表达。融合蛋白的相对分子质量约为25KD，能为PCV2阳性血清所识别。2、以表达的ORF2蛋白为包被抗原，建立PCV2的间接ELISA检测方法对间接ELISA检测方法的条件进行了优化，最终选择了ORF2蛋白的最适包被量为lug／ml，包被缓冲液为0．06M碳酸盐缓冲液，最适包被条件为4"C过夜

4、；封闭液为含有10％FBS的PBS’T，反应条件37℃，1h；待检血清稀释度为1：80，酶标二抗工作浓度1：2000，反应条件均为37℃，1h：底物37℃显色15min。建立的间接ELSA对PCV2抗体具有很好的特异性和敏感性。3、ORF2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以纯化的ORF2蛋白作为免疫原，腹腔免疫接种6．8周龄雌性BALB／c小鼠，最后一次加强免疫五天后进行细胞融合。间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆，亚克隆直到获得可产生单克隆抗体的稳定细胞系2株，分别命名为3H3和3F2，其亚型均为IgGl。猪网环稍毒2型间接ELISA检测方法的建立及ORF2蛋[j单克隆抗体的制备ELISA

5、测定2株单抗培养上清及其所制备的腹水效价，这2株单抗细胞培养上清在l：1600，腹水在l：51200时其OD450吸光值的P／N大于2．1，表明制备的单抗具有较高的效价。Westernblot分析结果显示两株单抗均能与ORF2蛋白发生特异性反应。这2株单抗的获得为进一步研究PCV2ORF2基因的功能及建立准确快速的PCV2的诊断方法提供了工具。关键词：猪圆环病毒2型；OKF2；间接ELISA；单克隆抗体2山东农业大学硕士学位论文DevelopmentandApplicationofIndirectELISAforPorcineCircovirusType2andPreparationM

6、onoclonalAntibodiesagainstORF2AbstractPorcinecircovirus2isthemainpathogenofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)，whichwasdividedintothefamilycircovirus，genuscircovirus．PMWSwasinitiallyrecognizedinweaningpigletsofaCanadianherdin1991，sincethenPMWShasbeendetectedinvirtuallyallregionsofthewo

7、rldwherepigsareproduced．PCV2hasincreasinglybeenassociatedwithvariousdiseasesyndromesinpigs，suchascongenitaltrembled，porcinedermatitisnephropathysyndrome(PDNS)，porcinerespiratorydiseasecomplex．Whatisworse，PCV2calldepresstheim