猪腹泻相关病毒多重和sybr greenⅰ荧光定量pcr检测方法的建立及初步应用

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ClassifiedIndex：Confidential(yes／no)：noCode：10224NO．120620500DissertationfortheProfessionalMasterDegreeEstablishmentandPreliminaryApplicationofMultipleandSYBRGreenIrealtimePCRDetectionforPorcineDiarrheaVirusCandidate：WUYangSupervisor：Prof．LiYijingDegreeCategory：MasterofVeterinaryScienceCollege：CollegeofVeterinaryMedicineResearchField：PreventiveVeterinaryScienceStudyMode：Full--timeHarbinChinaJune’2014 目录煳惭中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I⋯⋯⋯．．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1II1．前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1病原概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．1猪流行性腹泻病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．2猪传染性胃肠炎病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一31．1．3猪轮状病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41．2PEDV、TGEV、PoRV的诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2．1临床诊断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．2．2实验室诊断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3实时荧光定量PCR技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯101．3．1原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111．3．2分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111．3．3应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．4研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。132．1．1病毒及临床样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯．．132．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．3引物设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．1．4病料样品的处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1．5主要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．2．1单一病原体基因PCR扩增及测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2．2多重lmPCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．2．3PCR产物的回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．2．4目的基因片段与pMDl8．T载体的连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．5大肠杆菌JM．109感受态的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．6连接产物的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．7pMDl8．T基因重组质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一172．2．8测序及结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．9多重PCR扩增条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．10特异性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．11敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19 东北农业大学硕二1．学位论文2．2．12重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．13临床感染病料的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．14荧光定量PCR标准品的制备及标准曲线的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．15荧光定量PCR的特异性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．2．16荧光定量PCR的重复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．2．17荧光定量PCR的敏感性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一212．2．18荧光定量PCR临床样品检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯213．结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1多重PCR扩增条件的优化结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．1单一RT-PCR扩增及退火温度的优化结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．2多重RT-PCR引物浓度的优化结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．1．3多重RT-PCR循环数的优化结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2特异性试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．3敏感性试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．4重复性试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．5临床样品的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．6荧光定量PCR扩增目的片段电泳结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．7重组质粒测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．8荧光定量PCR标准曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．9荧光定量PCR重复性试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一313．10荧光定量PCR溶解曲线分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．11荧光定量PCR特异性试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．333．12荧光定量PCRl临床样品检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．334讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯354．1多重RT-PCR方法检测猪腹泻病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．354．2检测猪腹泻病毒的荧光定量PCR方法分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯355结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯375．1建立了检测PEDV、TGEV、PoRV的多重PCR方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯375．2建立了检测PEDV、TGEV、PoRV荧光定量PCR方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯375．3临床样品的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．O．．OO．．．．．O037致j射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41攻读硕士学位期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47II CONTENTSAbstractinChinese．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．⋯⋯．．．．．．⋯．．．．⋯．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯lAbstractinEnglish．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．II1Introduction．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11．1Summaryofpathogenic⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯11．1．1PEDV⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．．1．2TGEV．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．3】．．】．．3PoRV．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．．．．．．．⋯．．．．．．⋯．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．．．．．．．⋯．．．⋯．．．⋯．41．2ThediagnosismethodofPEDV,TGEV,PoRV⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．51．2．1Clinicaldiagnosis⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2．2Laboratorydiagnosis⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．．61．3RealtimePCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1()1．3．1Theory⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111．3．2Classification⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．3．3Application⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．4Researchpurposeandmeaning⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122Materialsandmethods⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1Theexperimentalmaterials⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1．1Virusandclinicalsamples⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．2Themainreagent⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．1．3Designandsynthesisofprimers⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．4Theprocessinoftissuesamples⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·142．1．5Themainequipment⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2Theexperimentmethod⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2．1AsinglepathogengenePCRamplificationandsequencing⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．2．2MultipleRT-PCRamplification⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·162．2．3PCRproductsrecycling⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·162．2．4PurposegenefragmentsandpMDl8-Tvectorconnection⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·172．2．5PreparationofcompetentescherichiacoliJM-109⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2．6Thetransformationofconnectionproducts⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．172．2．7IdentificationofpMDl8-Tgenerecombinantplasmid⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2．8Sequencingandanalysisresults⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·192．2．9OptimizingthemultiplePCRamplification⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·192．2．10Specifictest⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．2．11Sensitivitytest⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．12Repeatabilitytest⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··19111 东北农业大学硕士学位论文2．2．13Clinicalinfeciousdiseasetestingofmaterial．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．192．2．14PCRstandardofpreparationandtheestablishmentofthestandardcurve⋯⋯⋯．202．2．15Real—timePCRspecific．．．．．．．．⋯．．．．⋯．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．：!()2．2．16Real—timePCRrepeatability．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．212．2．17Real—timePCRsensitivity．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．212．2．18Real-timePCRclinicalsampletesting．⋯．．．．．．．⋯．．．．．．⋯．．⋯．⋯．．⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．213Results⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2：!：；．1OptimizingthemultiplePCRamplication⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．223．1．1SingleRT—PCRproductsandoptimalannealtemperature⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．2TheoptimalprimerconcentrationusedinmultiplexRT-PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．1．3TheoptimalcycleusedinmultiplexRT-PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．2Specifictestresults⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。．243．3Sensitivitytestresults⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．243．4Repeatabilitytestresults⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．5Clinicalsampletesting⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．．253．6Real·timePCRamplificationpurposeextractelectrophoresisresults⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．263．7Recombinantplasmidsequencingresults⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．273．8Real-timePCRstandardcurve⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯．273．9Real—timePCRrepeatabilitytestresults⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．313．10Real—timePCRsensitivitytestresults⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．323．11Real—timePCRspecifictestresults⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．12Real—timePCRclinicalsampletesting⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．334Discussion⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．354．1MultipleRT—PCRmethodfordetectingswinediarrheavirus⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．354．2DetectionofporcinediarrheavirusrealtimePCRanalysis⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．355Conclusion⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．375．1EstablishingmultipleRT-PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯375．2Establishingreal-timePCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．375．3Clinicalsampletesting⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37Acknowledgement⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯。⋯⋯⋯．39References⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41PaperspublishedintheperiodofPh．M．education⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．47IV 研究生学位论文独创声明和使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以松注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得——(注!垫遗查墓丝益墓挂剔岜圜鳆!奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：吴率日期：山中年6月矽日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：吴牛日期：af咿‘月／口日导师签名：李／降嗍年月日 摘要摘要猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)署11猪轮状病毒(PoRV)是引发猪病毒性腹泻的主要病原，且三种病原常常混合感染，建立同时检测三种病原的特异性检测方法，在临床诊断上具有重要意义。本研究根据GenBank登录的PEDVS基因、TGEVS基因和PoRVVP6基冈序列保守区设计合成引物，建立了RT-PCR多重快速检测方法。利州这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PoRV核酸模板进行多重RT-PCR扩增，结果显示：该方法可以同时扩增PEDVS基因(682bp)，TGEVS基因(480bp)和PoRVVP6基因(297bp)的特异性DNA片段，其三对扩增引物对除自身病毒以外的其他两种腹泻病毒及猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重RT-PCR方法检测灵敏性分别达到PEDV模板3．3x103copies／／aL、TGEV模板3．2x103copies／gL和PoRV模板2．8x103copies／pL。用20份临床病料对本研究建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR方法进行对比验证，结果显示：两者的总符合率为100％。该PCR反应体系为总体积259L，Taq酶(5U／#L)0．59L，引物量(PEDV0．8pmol／pL、TGEV1．0pmol／／比L、PoRV1．0pmol／／比L)0．靴L，35个循环，总反应时间94min，结果表明，建立的多重RT-PCR检测方‘法，具有特异、快速、准确的特点，可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。根据PEDV、TGEV及PoRV的锨乃基因和S基因以及VP7基因，设计的三对特异性引物进行的PCR反应，扩增出的目的片段分别为103bp、115bp和153bp，目的基因和载体pMDl8．T连接产物转化到感受态细胞JM．109，提取重组质粒，进行PCR鉴定并测序。重组质粒测OD260并计算其浓度，根据公式进行拷贝数计算。梯度稀释重组质粒制备标准品，分别建立了检测3种病毒的SYBRgreenI实时荧光定量PCR方法。建立的PEDV、TGEV及PoRV标准曲线且线性关系良好，相关系数分别为0．992902、0．987219和O．999045，扩增效率分别为O．93、0．99、1．15。特异性试验结果表明，PEDV特异性试验中TGEV、PoRV、PRV、HCV均为阴性；TGEV特异性试验中PRV、PoRV、PEDV、HCV均为阴性；PoRV特异性试验中PRV、PEDV、TGEV、HCV均为阴性；敏感性试验表明，3种病毒SYBRGreenI荧光定量PCR方法的最低检测下限分别为33copies／gL、32copies／gL、28copies／／aL：重复性试验结果显示三种检测方法的批内变异系数和批间变异系数均小丁．5％。说明本实验建立的3种病毒的SYBRGreenI荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性良好。应用建立的检测方法分别对黑龙江、内蒙等地的20份临床粪便样品进行检测，结果可见PEDV、TGEV及PoRV荧光定量PCR方法检测阳性率分别为70％、50％、35％，单一RT-PCR方法检测阳性率分别为60％、45％、20％。本研究建立的猪腹泻病毒多重和SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法为猪病毒性腹泻的流行病学调查及诊断与防制提供了基础。关键词猪流行性腹泻病毒；猪传染性胃肠炎病毒；猪轮状病毒；多重PCR；SYBRI 东北农业大学硕士学位论文GreenI荧光定量PCRlI ABSTRA(：TEstablishmentandPreliminaryApplicationofMultipleandSYBRGreenIrealtimePCRDetectionforPorcineDiarrheaVirusAbstractPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)，porcinetransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV)，andporcinerotavirus(PoRV)infectionarecommonviraldiarrhea，andoftenmixinfection．Toidentifyanddifferentiaterapidlythecausingpathogensofclinicaldiseases，amultipleRT-PCRwasdeveloped．Thepolymerasechainreactionwasoptimizedtosimultaneouslydetectthreepathogens，includingporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)，porcinetransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV)andporcinerotavirus(PoRV)．ThreesetsofspecificprimersweredesignedaccordingtOthesequencesofPEDV，TGEVandPoRVattheGenBank．Usingthreepairsofspecificprimers，aRT-PCRwasestablishedtoamplifYtheconservativeregionsofthethreeviruses，respectively．TheRT-PCRsystemwouldamplifya682bpfragmentforPEDV，a480bpforTGEVanda297bpforPoRVsimultaneouslyorseparatelyinthesamples，dependingonitsinfectionstatus．Butnospecificbandwasamplifiedfromothertwoviruses．Aslittleas3．3x103copies／／zLofPEDV，3．2x103copies／／比LofTGEVand2．8x103copies／／zLofPoRV．RNAcouldbedetectedusinggelelectrophoresis．UsingtheRT-PCR，20clinicalsamplesweredetected．ThedatashowedthatthemultipleRT-PCRmethodwas100％coincidentwiththesingleRT-PCR，anditcanbeusedforlhedetectionanddifferentialdiagnosisofthreeviruses．ThreepairsofnucleotideprimersweredesignedagainstthesequencesinORF3ofPEDV，SofTGEVandVP7ofPoRV，yieldingthreedifferentamplificationwithsizeof103bp，l15bpand153bpforPEDV，TGEVandPoRVrespectively．TherecombinantplasmidspMD-ORF3，pMD-SandDMD．VP7wereconstructedrespectively．ThepositiverecombinantplasmidwereidentifiedbyPCRandsequenced．ThequantitativeSYBRgreenIreal·timePCRsystemwasdevelopedfordetectinganddifferentiatingofthethreeviruses．Alinearrelationshipwasobtainedbyusingtherecombinantplasmids．Thereactionsystemandamplificationprotocolwereoptimizedwithprimersandparameterofcycle．TheresultsshowedgoodlinearitywiththecoefficientcorrelationfR2)0．992902，0．987219and0．999045forPEDV，TGEVandPoRV，andtheefficiency0．93，0．99，1．15forthethreeviruses，respectively．Thesensitivitylimitwerelessthan33copies／,uL，32copies／／zLand28copies／／zLforPEDV,TGEVandPoRV．Theinter-andintra—coefficientsofvariationfCV)werelessthan5％．AtotaloftwentyfecalspecimensfrompigletswithacuteIII 东北农业大学硕士学位论文gastroenteritiswerecollectedfromHeilongjiangandNeimengetc．TheyweretestedforPEDV,TGEVandPoRVbyreal-timePCRandcomparedwithconventionalRT-PCR．ThepositiverateofPEDV,TGEVandPoRVwas60％，45％and20％byRT-PCR，whilethepositiveratewas70％，50％and35％bySYBRgreenIreal—timePCR．TheresultsofthisstudydemonstratethattheSYBRGreenIreal—timePCRconstitutesaneffectiveandeasy-to—performmethodfordetectingPEDV,TGEVandPoRVinfecalsamples．Thedevelopedassayrepresentsapotentialtoolforlaboratorydiagnosticsandquantitiveassayfor，threeviruses．Keywords：PEDV；TGEV；PoRV；multipleRT-PCR；SYBRGreenIreal—timePCRCandidate：WuYangSpeciality：PreventiveveterinarymedicineIVSupervisor：Prof．LiYiJing 前言1．前言猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)，猪传染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)及猪轮状病毒感染(Porcinerotavirus，PoRV)是常见的猪病毒性腹泻，这三种病毒性腹泻造成药物和饲料报酬的递减，人类遭受的损火增加，是一种严重的疾病，危害养猪场。三者均为高度接触性肠道疾病，分别由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)及猪轮状病毒(Porcinerotavirus，PoRV)引起，其临床症状、病理变化和流行病学非常相似，临床和组织病理学很难区分，而且各种年龄的猪均易感染PEDV和TGEV，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，特别是哺乳仔猪受害最为严重。因此，建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测方法对疾病的诊断和防治具有非常重要的意义。多重PCR方法是在同一反应体系中利用多对引物同时对多个目的基因进行扩增，无论是用于检测单一感染病原的不同基因型，还是对于2种或者2种以上混合感染病原的检测，其敏感性和检测速度都优于单一的PCR检测方法，具有较高的实用价值，对y-PEDV、TGEV和PoRV进行快速鉴别诊断的建立，为进行猪病毒性腹泻的流行病学调查和防控奠定了基础。荧光定量PCR是新发展起来的一种检测技术，荧光染料预混到PCR体系，通过荧光强度的变化对PCR进行实时监测，反应结束后通过标准曲线对待测样品进行准确定量，通过分析溶解曲线对待测样品进行定性分析。本研究应用SYBRGreenI实时荧光定量PCR技术建立3种病毒的SYBRGreenI实时荧光定量PCR诊断方法，为猪病毒性腹泻的流行病学调查及诊断与防制提供了基础。1．1病原概述1．1．1猪流行性腹泻病毒1971第一次发现，在英国，主要以架子猪和育肥猪腹泻为症状，当时被称为“流行性病毒性腹泻”：1977年初次报道后，侵害哺乳仔猪有类似TGE的急性腹泻的临床症状，在排除了TGEV和其余相似的肠道致病性病原后，将该病称为“2型PEDV”，以区别予20世纪70年代早期发现的1型腹泻，然后分离出该病的病毒，被命名为CV777。1982年将该病统一命名为“猪流行性腹泻(PED)”。该病在许多国家和地区报道过如比利时、荷兰、德国以及法国，日本和中国台湾也证实有该病。自20世纪80年代初中国内地就陆续有本病发生的报道，并分离到病毒。为了确定猪流行性腹泻病毒的存在，在1982．1990年间，除澳大利亚和北美外，德国、法国、英国、荷兰、保加利亚和中国台湾许多国家和地区对该病进行了全面的血清学检测， 东北农业人学硕，l：学位论义结果都检测到了特异性抗体【1_21。在欧洲和中国以及许多国家，韩国[31_；}11日本141都得到了该病毒。在韩国，PED引起所有日龄猪腹泻。1992年1月至1993年12月份期间，韩国兽医研究所诊断的71个病毒性肠炎病例中，人?卜都确诊是PED。PED儿乎全年都有发生，但寒冷季：{，是发病最高的季。扎而且该病警全国性流行，90％发病的仔猪日龄均在丁．10日龄之内【5】o近年来，由丁欧洲术断奶仔猪PED感染日渐减少不再流行，所以较少看剑发表血清学检测或诊断相关的研究报道。主要感染PEDV引起的腹泻集于架子猪、育肥猪以及青年种猪，可能是因为病毒的流行病学特点以及初乳免疫保护哺乳仔猪的原冈所致。在育肥猪场进行的纵向研究中VanReeth等学者发现，在1993年9月进场的十组不同米源的架子猪进行血清学检测结果未出现血清阳性，而1994年2月进场的七组架子猪却在进场1周内却有腹泻症状，并从粪便中检出猪流行性腹泻病毒，4周后检测为血清阳性。在西班牙，15个猪场中超过?卜数猪场发生的急性水泻由猪流行性腹泻引起，并且其中一个猪场的少部分母猪有持续腹泻的症状16J。1992．1993年，对两班牙的部分猪场进行血清学调查，发现五千多头母猪中有一千多头体内含有猪流行性腹泻特异性抗体，八百个母猪场有一!|，^以上检测山现血清学冈I性猪。与欧洲相比，弧洲发病情况是PEDV病毒引起的腹泻致多E率更为严重，在l‰床症状上与典型的急性猪传染性胃肠炎(Porcinetransmissiblegastroenteritis，TG勘很是相似，造成的经济损失十分严重。此病流行程度与欧洲发生的类似，呈地方性流行，并出现群体免疫。1994年对于韩国7个省屠宰猪中发现在469份血清进行血清学中检测得到有17．6％．79％的猪存在PEDV抗体，平均阳性值为45％，这表明该病毒在该国～些地方呈地方性流行【71。本病由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引发，是猪的一种急性接触性肠道传染病，PEDV主要是因为感染猪的粪便而传播，自然感染病例发现人多感染是经口摄入，粪-口是主要的并非惟一的传播路径。易于受影响的猪场常丁．销售或购进猪只的4—5天之间暴发急性PED。在传播途径上猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎无太人差异，但在发生过急性感染的猪传染性胃肠炎的基础上，猪场常常更易发生猪流行性腹泻f引。猪流行性腹泻最明显的症状是呕吐、脱水、拉黄白色水样稀便，一周龄内仔猪常常发生腹泻，3—4天后因腹泻脱水而死亡，即使部分康复后也会发育受阻，症状的轻重随年龄的大小有所不同，年龄越小，症状越严重。病猪体温正常或者稍高，精神萎靡不振，食欲减退或废绝。断奶猪、母猪常呈现精神委顿、厌食和持续腹泻(约1周)，并逐渐恢复正常。眼观变化仅限于小肠，小肠鼓胀，其内充满淡黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛变短；组织学变化，可见空肠段上皮细胞有空泡形成和表皮脱落，肠绒毛明显萎缩。肠陷隐窝深度与小肠绒毛长度的比值由正常1：7降至1：2或1：3。腹泻后2h，上皮细胞发生脱落p1。猪流行性腹泻病毒是冠状病毒属的一个成员，与猪传染性胃肠炎病毒有许多类似的地方，如病毒的结构、临床症状、对动物的损伤等，最易感的为未断奶仔猪，且这段日龄猪群2 前言的致死率可以达到95％。病毒粒子早多形性，接近J丁．圆形，直径为95．190nm。人多数病毒粒子有一个电子不透明的中央区，顶端膨火的纤突长18．23nm，从核农壳向外早放射状排列。与其他的l群成员相比，猪流行性腹泻病毒在遗传特点上与人冠状病毒(HCoV-229E)有更多相似之处，尤其是在M蛋白的氨基酸序列上。猪流行性腹泻病毒在小肠绒毛上皮细胞中增殖，属于RNA病毒，基因组为单股正链，不分1了段。基冈组包含6个开放读框(ORF)，从5’到3’顺序依次为ORFl(20346nt)；S基因(4152nt)；ORF3基因(675nt)；E基因(23Int)；M基因(68Int)和N基因(1326nt)。猪流行性腹泻病毒的细胞培养相对比较困难。最初是口腔接种后，收集小肠内容物从而得到病毒感染液。直至1988年，一些研究者发现猪流行性腹泻病毒的生长依赖在细胞培养基中的胰酶上，并且在Vero细胞上成功培养了猪流行性腹泻病毒，并猜测可能是因为胰酶对猪流行性腹泻病毒纤突糖蛋白具有切割作用，从而加强了病毒对Vero细胞的感染性I】叫，这种培养方法广泛应用在后续猪流行性腹泻病毒的分离鉴定、细胞培养和疫苗研制上【1卜圮l。一些研究者们在仔猪的膀胱细胞、肾原代细胞系上也成功繁殖了猪流行性腹泻病毒，之后又相继在IB．RS．2、MAl04、ESK、KSEK6、CPK等传代细胞系上成功培养了猪流行性腹泻病毒[13-14】。冈猪流行性腹泻病毒在细胞上的成功培养，对于猪流行性腹泻病毒理化特性、疫苗及其相关生物学特征的研究奠定了基础。1．1．2猪传染性胃肠炎病毒猪传染性胃肠炎(Porcinetransmissiblegastroenteritis，TGE)由猪传染性胃肠炎病毒(Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)引起的的一种疾病，可导致病毒性胃肠炎或致死性腹泻，特征为呕吐，严重腹泻和失水。各种年龄的猪均可感染发病，病死率很高，主要是10日龄以内的仔猪，病死率可达到100％，5周龄以上猪的死亡率很低，成年猪几乎没有死亡。1945年Doyle和Hutchings首次报道美国有本病的发生，并了解了该病感染因子的可滤过性【151。1956年在日本发生猪传染性胃肠炎，1957年在英国发生【16-71，之后多个国家都报道有猪传染性胃肠炎的感染，因高死亡率给养猪业带来重大的经济损火ll扣川J。1964年在我国初次分离到猪传染性胃肠炎病毒，1973年上海、吉林、黑龙江等地报道有该病的发生，到2000年我国大部分地区都存在有猪传染性胃肠炎病毒。猪传染性胃肠炎病毒感染新生动物小肠上皮细胞，从而引发致死性的胃肠炎，在少数情况下感染也发生在上呼吸道。在成年动物，猪传染性胃肠炎病毒只引起比较温和的病症。怀孕母猪免疫致弱猪传染性胃肠炎病毒不足以保护哺乳仔猪免受感染，母源抗体在一定程度上可以起到保护仔猪作用。猪传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属的成员，有囊膜，形态多样，呈圆形、椭圆形和多边形。只有一个血清型，基因组为单股正链RNA，大小约为28．6kb，病毒直径为60．160Bm【21】，与猪流行性腹泻结构有许多相似之处【22五31。猪传染性胃肠炎病毒复制增殖过程中，至少有八种病毒特异性的mRNA合成，包括三种重要的结构蛋白：纤突糖蛋白(S，220KDa)，膜糖蛋白(M，29．36KDa)，和核蛋白(N，47KDa)，分别是基因2、基因6、3 东北农业人学颂．1：学位论义基冈7翻泽的产物。S蛋白形成病毒包膜上的囊膜突起并诱导产生中和抗体，通过与小肠上皮细胞中人量表达的胞外酶．氨基肽酶N(AminopeptidaseNProtein，APN)结合介导TGEV与宿主细胞融合，S蛋白上有APN结合域，与其他冠状病毒不同，TGEV、FIPV、CCoV的S蛋白没有裂解成两个蛋白。M蛋白儿乎全部包在病毒的脂质囊膜中。N蛋白与基冈组RNA结合形成核农壳。ORF4编码一个小膜蛋白，被假定是与病毒膜形成相关的多肽124‘2列，基冈3、基冈5、基冈8编码病毒的非结构蛋白。目前，猪传染性胃肠炎病毒较敏感的培养细胞有猪甲状腺细胞、唾液腺细胞、ST细胞【261和猪胎肾细胞【27】。近年米，实验室TGEV主要细胞培养系为ST、PKl5细胞系。1．1．3猪轮状病毒轮状病毒感染主要是婴幼儿和多种幼龄动物(包括牛、羊、兔、鹿、马、猴、犬及家禽)的一种急性肠道传染病，特征为腹泻和脱水。成人和成年动物多是隐性感染。近年来在世界许多国家都有轮状病毒感染的报道，我国也从患腹泻的人和多种动物中分离到该病毒。本病不仅感染率高而且有时伴随发病率也比较高，较人危害到人类健康和畜牧业发展，冈此备受关注。1969年，Mebus最先从犊牛中发现该病毒，随后在人和多种动物的粪便中分离获得【28。叫，之后澳大利Ⅱ科学家(Bishop)在患有严重腹泻婴儿的胃肠道内也发现了同类病毒。轮状病毒属呼肠孤病毒科、轮状病毒属。在形态上，人和各种动物的轮状病毒无法加以区别，有11个双股RNA片段组成，有双层衣壳，如此命名冈像车轮。本病毒与同科的其他病毒无抗原关系。各种动物和人的轮状病毒内农壳具有共同抗原(群特异抗原)，通过免疫荧光、补体结合、免疫扩散和免疫电镜检测出来。本病的传染源为病人、病畜和隐性患畜。病毒主要集中在肠道内，随粪便的排出而感染外界环境，污染饲料、饮水、垫草及十壤等，通过消化道途径感染易感家畜。痊愈动物可从粪中排毒持续期至少可达到3周。病畜痊愈获得免疫主要是细胞免疫，对病毒的持续存在影响时间并不长，所以病愈动物可以再次被感染。据调查，在撒哈拉以南的非洲和亚洲地区，轮状病毒引起超过三分之一的婴幼儿腹泻及胃肠炎疾病，每年50万到60万婴幼儿死于该病，我国最初关_丁．轮状病毒的报道是在1979年学者从儿童粪便中检测获得【31】，随后在仔猪、犊牛等多种动物的粪便中也分离到了轮状病毒【321。在不同地区感染的普遍性表明，降低轮状病毒的感染率和发病率并不仅仅只能通过提高生活卫生水平。另外，尽管研发的一些药物可使轮状病毒感染引起的临床症状得到缓解，但目前还没有治疗轮状病毒感染的特效药物。轮状病毒的血清型与疾病的严重性没有太大的相关性，各种轮状病毒的交叉免疫保护机制尚不明确，因此需要加深对轮状病毒感染机制的研究，研发出安全有效的疫苗对预防轮状病毒感染显得十分重要。猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒(Porcinerotavirus，PoRV)引起的，各种动物感染轮状病毒病变基本相同，病变主要集中于消化道。幼龄动物胃壁弛缓，内充满凝乳块平¨乳汁。小肠肠壁非薄，?I，．透明，内容物呈液状、灰黄或灰黑色。有时伴有小肠大量出血，肠系膜淋巴结肿大。仔猪感4 前言染后发生严重的胃肠炎，肠绒毛萎缩，水样腹泻粪便黄色或白色，脱水，但在无其它肠道病原菌一同感染的情况下，轮状病毒腹泻在哺乳仔猪症状较轻，持续2．3天，死亡率一般不超过15％，但它通常呈现和其它肠道病原混合感染，发生严重腹泻，高发病率和高死亡率【33。341。据研究调查，7．14日龄哺乳仔猪或是断奶后一7天内的仔猪最易感染猪轮状病毒腹泻【35．361。凡是有轮状病毒排出的严重腹泻，一般均伴有猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒以及人肠杆菌等病原显现混合感染ly7。391。轮状病毒是带有短纤突且外缘光滑近似车轮状的粒子，该病毒粒子由3层蛋白衣壳组成：外层衣壳(vP7和VP4)、中间层农壳(VP6)矛11内层衣壳(VP2)。通常传染性粒子都包裹3层衣壳蛋白。病毒基因组被内层农壳、RNA依赖性RNA聚合酶(VPl)及修饰酶(VP3)包裹，组成由11个不连续的dsRNA，编码6种结构蛋白fVPl．VP4／VP6／VP7)乘I6种非结构蛋白(NSPl．NSP6)，除第11个：肖段含有两个开放阅读框并编码NSP5和NSP6外，其他每=肖段都能编码一种蛋白。在宿主体内，由不同株轮状病毒引起的共感染常常会造成11个基因节段发生基因突变重组，产生新型的轮状病毒。轮状病毒编码的位于中间农壳的VP6蛋白具有高度保守性，常称VP6蛋白为群抗原或诊断抗原，依据其抗原性的不同可以将轮状病毒分为A．G七个种群，A群大多属于感染人的轮状病毒，进一步可以将轮状病毒分为2个Ⅱ群为23个G(G1．G23)1111清型(取决丁．VP7中和抗原)和31个P(P【1】．P[131)1111清型(取决丁VP4血凝素抗原)。病毒的VP7和VP4共同决定了G．P组合血清型，目前，危害人类健康最为重要的毒株是G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]希IG9P[8】五种血清型的轮状病毒，其中在我国最为常见的是GIP[8I．手,G3P[81型。1．2PEDV、TGEV、PoRV的诊断方法临床诊断和实验室诊断是诊断这三种病毒的主要方法。临床诊断主要是通过临床症状和病理剖检的特征性病变以及流行病学等特点作出判定。实验室诊断技术主要包含有电镜及免疫电镜技术、免疫荧光、中和试验、对流免疫电泳、凝胶免疫扩散实验、酶联免疫吸附试验、补体结合实验等，在～定时期内这些方法是检测这三种病毒的重要方法，但仍然存在一些不足之处，主要是这些方法操作耗时长，低敏感性。但随着分子生物学技术的飞速发展，提供了一些更简便更准确的诊断病毒的实验室检测方法，如核酸探针杂交检测技术和聚合酶链式反应等。由于这些方法的敏感性更高、特异性更强，渐渐成为检测这三种病毒的主要方法。1．2．1临床诊断临床上这三种病毒常常混合感染，而且均伴有腹泻症状，腹泻程度及粪便等有所不同，病变部位集中在胃肠，通常猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病程较短，发病快，仔猪死亡率较高。三种病毒对不同日龄的猪致病性也有所差异，猪传染性胃肠炎病毒主要感染10日龄内仔猪且发病率很高，经过5．7天后成年猪能够恢复健康，几乎零死亡，各种日龄均能被感染；各种日龄均能被感染猪流行性腹泻而引发疾病，与猪传染性胃肠炎相比，只是病死率稍5 东北农业大学硕：I二学位论文低，在传播速度上也没有也比猪传染性胃肠炎慢‘40】；猪轮状病毒引起7．41日龄猪发病，发病率死亡率较高是1．14日龄的仔猪。通过流行病学、临床症状、病例剖检可作初步诊断，确诊需运J}}j实验室检测方法。1．2．2实验室诊断1．2．2．1病毒的分离鉴定(1)PEDV的分离鉴定人jI_：引发感染的仔猪，接种四天后用电子显微镜可以眼观到粪便中的病毒粒子，冈此可直接用病猪的粪便检查猪流行腹泻病毒粒子或者应用胎猪肠组织原代细胞或者Vero细胞等进行传代培养观察病毒粒子结构。还可以应用仔猪感染试验，选用2．3日龄不喂初乳的仔猪，将病猪小肠组织或者肠内容物制成悬液，经口服感染仔猪，如果试验猪发病，采用小肠组织进行免疫荧光实验。PEDV的体外培养比较困难，早期许多研究者对PEDV的适应细胞系进行许多的尝试，但是都没有取得成功。我国学者宣华等曾利用胎猪肠组织原代细胞进行分离PEDVl4¨，但未有后续的报道。Hofmann等首次在培养基加入胰酶的Vero细胞上成功培养了猪流行性腹泻病毒【4引，随后对于猪流行性腹泻病毒的分离培养和疫苗的研发中被广泛应川，各国学者对丁猪流行性腹泻病毒的培养进一步深入研究，在仔猪膀胱、肾脏原代细胞和MAl04、CPK、ESK的传代细胞系上成功繁殖了猪流行性腹泻病毒。(2)TGEV的分离鉴定取病猪的肛拭子，粪、肠内容物以及空肠同肠段作为病料，口服感染5日龄仔猪，或将病料处理后接种在ST细胞、PK．15细胞，盲传两代以上，同时设立朱接毒细胞作为对照组，37。C孵育，分离获得病毒，接种于仔猪依照仔猪的临床症状，病理学变化以及细胞病变，通过血清中和试验、免疫荧光方法进一步鉴定确诊，或依据免疫电镜进行形态学观察，最终确诊。(3)PoRV的分离鉴定最理想的方法就是电镜检查，但要求每克粪中病毒颗粒含量不能少丁．105，用免疫电镜方法可以提高其灵敏性。近年来广泛采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，检测粪样中的轮状病毒的RNA，并可依据电泳图谱将其分群，也可应用RT-PCR检测粪样中的RNA。分离轮状病毒通过细胞培养手段比较困难，一般采用MA．104细胞系(恒河猴肾细胞)连续传代培养。如j：}；l胰蛋白酶(10．2099／mL)处理样本可裂解病毒的外层农壳蛋白VP4，从而有助于病毒粒子脱壳感染细胞。初次分离的毒株往往无细胞病变，旋转培养经传代后才出现，一般应．}=}j添加胰蛋白酶(0．5．和g／mL)的无血清的营养液作为维持液。病毒按种24h后就可出现CPE，表现为细胞肿胀变圆、细胞集聚、边缘模糊、萎缩，一些细胞间有胞浆相连，最后细胞死亡脱落。随着传代次数的增多，病变程度加重，出现病变的时间也越来越短。6 前苦1．2．2．2血清学和免疫学方法(1)酶联免疫吸附试验ELISA是当前应刚范围最广、发展相当快速的一项技术【4引。该方法优点就是灵敏度高、特异性好【4引，并且操作简便且价格便宜，试剂不易火活，但仅仅能判断有无轮状病毒感染的定性测定，但对于血清分型发展还不太完善1441。近年米发展的快速ELISA、Dot．ELISA方法具有较高的灵敏度，试剂用量少，用时少、操作简单方便1451，该方法可以川米检测粪便上清液中的病毒抗原【4州，而且实验操作简便，适合人批量样本的检测。目前，也会ELISA与其他方法联合使用，进行联合诊断【471。采用夹心法或双抗体夹心法，检查样晶病毒抗原，可测出较小含量的病毒抗原，敏感性高，为了达到特异性强的目的应使刚高纯度的免疫血清，肉眼可观察结果，方法简单易于操作，适合于大规模样品的检测，但该方法也有弊端，如易受到实验环境、样品中非特异性蛋白、反应板质量和抗体纯度等多种因素的影响，结果易出现假阳性。目前应用夹心法比较多，用于检测大分子抗原。将纯化的特异性抗体结合在固相载体上，加入带测定的病毒抗原，培养后，去除多余未结合的抗原，接着加入酶标记的特异性抗体，使特异性抗体与嘲相载体表面的抗原结合，再洗涤朱结合的酶标抗体结合物，然后加入酶的底物，经酶催化作川后产生有色产物的量与溶液中的抗原成止比。有学者运用猪传染性胃肠炎病毒的重组核蛋白建立了一种血清学ELISA诊断技术【4引，HouXL等利川猪流行性腹泻病毒的重组核蛋白建立了ELISA诊断技术【491，此外还有一些学者对用于PEDV诊断中的ELISA和中和试验进行了比较150J。王树成等分别刚血清中和试验(SN)和单克隆抗体(TGEmAb和TGE／PRCVmAb)ljg断酶联免疫吸附试验(B．ELISA)，对美国进口猪的血清做猪传染性胃肠炎病毒抗体检测【511。(2)胶体金免疫层析20世纪90年代，胶体金免疫层析法(Goldimmunochromatographyassay，GICA)快速诊断试纸条是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料新技术基础上发展起米的一项新型体外诊断方法。随着它的发展迅速，在生物医学领域特别是医学检测中得到了广’泛应用。该方法主要是将特异性的抗原或抗体以条带状的形式吸附在NC膜上，胶体金标记试剂附着在结合垫上，当待测样品滴加到试纸条一端的样品垫位置后，由于毛细作用使之向前移动，使结合垫上的胶体金标记试剂溶解后相互作用，当移动到固定的抗原或抗体的位置时，待测物和金标试剂的复合物又与抗原或抗体发生特异性结合而被制止停留，集聚在检测带上，肉眼观测胶体金标记物从而得到直观的显色结果。而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分开的目的【52‘531。该方法最大特点是单份测定、简单便捷、特异性强敏感性强，无需任何仪器设备和试j；f!J，短暂时间就可用眼观到实验结果，实验结果可用于保存。Kan2JH等研制一个检测PoRV的粪便样品通过应Ⅲ简单易行的免疫层析技术【54l。目前韩国Anigenanimalgenetics公司已开发出商品化的快速检测试剂盒RapidAgTestKit(免疫层析检测试剂盒)，检测样品简单方便，但成本较高。(3)免疫荧光荧光抗体试验常用于鉴定肠冷冻切片，是一种用时短灵敏性高的检测技术。采用新鲜的7 东北农业火学硕士学位论文小肠病料，最好是刚山现临床症状。采集小肠的后部分段病料置丁．干冰中冷冻，制成冷冻切片，转移到盖玻片上川丙酮蚓定，同时设立阴性对照和肝卜眭对照。切片用PBS润洗后滴加FITC标记的抗病毒抗体。在37℃培养箱中作用30min，PBS冲洗将米结合的抗体去除，切片川稀释的伊文斯监复染，甘油封片后置-丁．显微镜+卜．观察，结果判定的主要依据是肠绒毛结构保存的完好程度以及上皮细胞是否出现胞浆荧光。间接免疫荧光也可以用做这三种病毒的检测，将细胞铺满96孔板，等到细胞单层铺满时，将细胞上分离培养的病毒接种到96孔板上，24h后去掉培养液吲定细胞，经过TritonX．100透化处理细胞，PBS润洗白然干燥后加入稀释好的抗病毒的一抗作用45min，弃掉一抗后再用PBS润洗自然干燥，加入对应的FITC标记的二抗，37。C培养箱中作用45min，再用PBS润洗后覆盖甘油在荧光显微镜下查看结果。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所成功开发了扁桃体采样器，将采集的猪扁桃体做成冷冻切片进行IFA，检测猪传染性胃肠炎病毒。李丹丹等利用抗猪传染性胃肠炎病毒Ⅳ蛋白的单克隆抗体，采川IFA检测猪传染性胃肠炎病毒的细胞培养物，并同猪传染性胃肠炎全病毒制备的抗血清作比对，以评价抗猪传染性胃肠炎病毒Ⅳ蛋白单克隆抗体在TGEV快速检测的应用价值155J。1．2．2．3分子生物学方法(1)核酸探针杂交技术由于特异性高利灵敏性高，核酸分子杂交已成为分子生物学中最普遍应用的方法，被广泛运用在基因克隆的筛选，制作酶切图谱，基因突变的检测及基因序列的定量和定性分析等。其原理是具有同源性的核酸单链在特定的条件一F(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补配对原则形成舣链。待测核酸序列及探针(probe)进行杂交，待测核酸序列可以是克隆的基冈片段，也可以是未克隆化的基因组DNA或者是细胞总RNA。探针是指带有某些标记物(如放射性同位素32P和35S、荧光物质异硫氰酸荧光素等)的已知序列结构的特异性核酸片段。若设法让一个核酸序列带上32P，这个核酸序列与靶序列互补形成的杂交双链，就会带有放射性。运用合适的手段接受来自杂交链的放射信号，即可确定靶序列DNA的存在及其分子量。根据来源和性质可分为cDNA探针、寡核茴酸探针、基冈纽探针、RNA探针等；根据标记探针的物质不同，又可以分为放射性探针和非放射性探针。PEDV、TGEV和PoRV都是RNA病毒，逆转录得到的cDNA标记后可以与病毒的mRNA发生特异性的结合，通过分析杂交信号从而检测病毒。1987年ShockleyLJ等通过制备cDNA探针，长为2000bp，应用核酸杂交方法对多种动物冠状病毒进行检测【5们，之后BenfieldDA等建立了朋32P标记探针的斑点杂交试验检测猪传染性胃肠炎病毒【5引。JungK应用地高辛标记的cDNA探针检测粪便样品，同时对PEDV和TGEV进行鉴别诊断，检测结果与RT-PCR相同，与RT-PCR相比，敏感性要蒯581。KimB等也建立了地高辛标记的cDNA探针原位杂交方法用于检测猪传染性胃肠炎病毒【5们。我国学者朋光敏生物素标记A群轮状病毒全基因组RNA，研发出群特异性核酸探针，可最小检出量为100pg[601。(2)聚合酶链式反应8 前斋聚合酶链式反>J晦．(PolymeraseChainReaction，PCR)：是一种类似丁．体内DNA复制过程的体外酶促扩增特异DNA片段的技术。以待扩增的两条DNA序列为模板，利用两条与待DNA片段相邻的核苛酸序列互补的寡聚核苛酸引物与变性DNA一起退火，经过变性、退火、延伸二个步骤约二十个循环可将DNA片段成百上千倍地扩增，敏感性高，而且三个步骤的交替都是通过温度的改变米完成的【61】。由丁引物3’端与DNA革巴模板结合需严格互补，因此PCR技术特异性很高。随着耐热的TaqDNA聚合酶和自动PCR仪的出现，缩短了反映的时间，操作简便易行。因PCR试剂盒的出现，使PCR方法自动化，操作更加简单、便捷，所以被普遍地运用。因此，从1985年美国公司研发了PCR方法，该项技术在分子生物学研究中已得到了普及。人们在实际应用进程中，根据不同的要求，对PCR技术进一步改善，出现了许多改良的PCR方法，如反向PCR、锚定PCR、巢式PCR、定量PCR、原位PCR、免疫PCR、套式PCR、多重PCR等。因这些技术的出现，加人了PCR方法的实际应刚范围，所以促进了分子生物学技术拓展，使RNA检测的灵敏性提高了儿个数量级，使一些极为微量RNA样品检测成为可能【珏67l。该方法主要用-丁．分析基冈的转录产物，获取目的基因，合成cDNA探针，构建RNA高效转录系统。RT-PCR方法可以快速准确地直接从病料检测出微量病毒【68。701。在单一PCR基础上，多重PCR(MultiplexPolymeraseChainReaction，MPCR)是发展起来的一项新技术，在同一个反应体系中加入多对引物，分别扩增不同的模板，得到不同的目的基因。这种方法不仅保留了常规PCR方法的高特异性、高敏感性的优点，操作也简单化，又节省了实验试剂用量，在同一体系中可以检测多种致病茵的特异片段。应Hj多重PCR反应，可同时检测多种致病菌。不管是在由致病微生物引发的传染病诊断方面，还是在环境中致病微生物的检测范畴，多重PCR方法都有比较开阔的运川前景，尤其是在临床混合感染的诊断上具有得天独厚的优势和较高的应朋价值【62l。目前从病原微生物的检测方面看，多重PCR，’‘泛适州于临床、疾病检测、食品卫生监测及流行病学调查等。在同一PCR反应中利刚多对引物同时进行扩增，同时可以扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR都相同。但与单一PCR相比，多重PCR具有以一FJL个特点：①系统性，能够全面、系统、准确地对病原体进行检测与鉴定，并且操作简单快捷，具有较高的特异性和灵敏度。多重PCR适合多种病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病等的同时检出：②高效性，在同一PCR反应体系内同时检出多种病原微生物，或对有多个类别的目的基因进行分型。应用多重PCR方法可以大火提高检出效率、缩短反应时间，具有显著的社会与经济价值；③经济：1y省，多种病原微生物在同一反应体系内同时检出，特别是用少量样本就可检测出多种病原微生物，对初始样本质量要求不高，PCR技术对仅含极微量目的DNA(pg、ng)、DNA粗制样品或者总RNA都可以检出，都可用起始样品米获得较多的目的产物。扩增样品可以是纯化的或为粗制的；也可以是新鲜样品，又或健陈旧组织；既能是细胞，也可以是粪便；既可以是完整的人分子，也可以是部分降解的DNA。缩短反应时间，减少反应试剂用量，：铮省开支，更加准确地检测多种病原微生物。q 东北农业大学硕士学位论义多重PCR虽然是高特异性，高灵敏性，方便快捷的方法，但在实际操作麻刚中也存在不少问题，主要关注的就是污染问题。一旦有少量外源性DNA污染，结果就可能是假阳性的；应川多对引物同时扩增目的基冈，实验程序控制不当，扩增火败或扩增山非特异性产物可能性很人；设计引物序列及靶序列的不当等都可能导致灵敏度和特异性降低。另外，检测食品样品时，增菌培养基选抒不合适易使一些细菌生长停滞或受到抑制，产生假刚性。日后的发展前景主要集中在以一F)L个方面：①增加反应体系中引物对的数量，提高一次PCR反应所能检出的样品数；②反应条什优化，提高PCR效率；③研发挑选能同时富集多种病原细菌的培养基；④联合其他方法，如荧光定量PCR、反转录PCR，使敏感性和特异性加以提高，缩短时间的消耗。⑤加强对实验室的治理，对实验室进行严格的分区等。虽然多重PCR方法有一些不足，但随着该方法的进一步完善，可能在检测食品病原细菌中得到更多的应用。在多重PCR检测病原菌方面，优势就在于能够直接检测简单处理过的样本，达到快速检测的目的。确定多重PCR试验方案时，特别注意反应体系中各成分的量和反应条件等。在确定好反应体系及反应程序时，也要重视不同的样品和引物对实验条什的要求从而加以调整，从而保证准确无误的结果。与常规PCR相比，多重PCR具有得天独厚的优越性，耗时短HJ量少，一次PCR可以检测多个病原微生物，．I：作量减轻，并提供了阴性对照，能够反应山模板的数量和质量。目前遗传疾病和传染性疾病的诊断的发展趋势已经从人量的单一PCR方法改为多重扩增，监测个体、群体和病原体，辅助人类基冈组构成分析等。与核酸杂交相比，多重PCR方法更加敏感、快速，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病原体样品，在科研_j}11临床领域将会有更广阔的发展空间。随着多重PCR技术在传染性疾病病原菌诊断中的应用，方法本身必将不断修改和完善，同时也促进了该方法在其他领域的普及。(3)荧光定量PCR在研究传染病的病毒性病原菌和阐明传染病的进程，Real．timePCR方法是有用武之地的。传统的方法没有关注到病毒的定量检测，然而目前反之，使得real．timePCR在病毒学研究的很多方面成为一个关注的焦点。Seong．HeeKim等以FAM和Cy5标记探针建立了二重荧光定量RT-PCR方法诊断猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒，可以同时检测猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒；检测下限分别为9x101eopies／∥L和7x101copies／／卫L171】。我国许多学者也建_立-j-检测轮状病毒应用实时定量PCR方法1721。1．3实时荧光定量PCR技术与常规的PCR方法不同之处是，Real．timePCR方法是在PCR反应样品中加入荧光染料或荧光探针，随着荧光信号积累可以实时监测整个PCR反应进程，对未知模板通过标准曲线进行定量分析，具有操作简单易行、快速高效，高敏感性等特点，该技术在分子生物学研究、分子诊断、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广‘阔的发展空间。只有进行人量的后期处理工作，传统PCR才能评估扩增的效率，依赖于核酸凝胶电泳检测目的片段，并通10 前言过紫外光照射后扫描看是否有目的条带。然而荧光定量PCR不具备以上缺点，达到了样品检测简便化，无需进行后期操作，也不会有污染问题。1．3．1原理1995年美国PE公司推出实时荧光定量PCR技术(Real．timeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReaction)，Heid等首次报道其原理及其使用方法。Real．timePCR技术，是指在PCR反应体系中添加荧光染料，随着荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，制作标准曲线对待测样品进行定量分析。简单地说，实时荧光定量PCR的原理就是模板核酸扩增呈指数增长，当反应体系和反应条件相同时，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应中的荧光染料或荧光标记物与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。与常规PCR相比，不仅实现了对模板的定性与定量检测，而且特异性强、敏感性高、自动化程度高，污染性小，避免了常规PCR后期处理问题，目前已在病毒学、基因工程等多种领域中得到了普及。在荧光强度米检测样品，其检出方法可分为荧光嵌合法承f荧光探针法两类。1．3．2分类(1)荧光嵌合法目前主要使用的是SYBRGreenI、LCGreenTM—I、YOYO、YO—PRO-I和BEBO，以上方法有较多的好处，如对模板要求比较低，花费少等，其中SYBRGreenI较为普遍。SYBRGreenI是一种带有绿色激发波长荧光素染料，结合于双链DNA小沟处，它的发射波长和最火吸收波长分别为520nm和497nm。SYBRGreenl与双链DNA小沟结合后，发出荧光信号。PCR反应过程中，尽管加入过多的SYBR荧光染料，荧光染料特异性地与DNA双链结合，发出荧光信号，而多余的SYBR荧光染料不会发出任何荧光信号，对荧光强度的检测即是实时监测PCR扩增产物增加量。SYBRGreenI荧光检测方法有很多优势之处，主要是操作简单，成本低廉，无需合成特异性探针，程序设计通刚性好。通过熔解曲线可以分析是否有目的基因，是否含有非特异性基因的扩增，进一步发展还可以实现多重荧光定量的检测。(2)荧光探针法探针法是指PCR体系中在加入引物的同时需要加入特异性的荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团(R)和一个淬灭荧光基团(Q)。随着每产生一条DNA链，就切断一条探针，一个单位信号就将形成，信号强度强弱与与结合探针的DNA分子数相关。1．3．3应用 东北农业大学硕士学位论文Real．timePCR继承与弘扬了普通PCR的快速高灵敏度等优点，又避免了普通PCR不能精准定量分析和易污染等问题，拓宽了PCR技术的麻用范同，I‘i有举足轻重的地位。目前实时荧光定量PCR技术已经在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域得到发展。主要集中在以1V)L个方面：①检测病原微生物或病毒含量。采川Real．timePCR方法可以同时做到定性和定量分析病原微生物，在临床检验和致病机理上意义重人。目前该方法已经检测多种病原体，如乙型肝炎病毒、流感病毒等病原体的检测【『73J。2005年，Persson(uSA)，在荧光定量PCR的基础上，进一步运用四种不同的荧光标记的DNA(cDNA)，同时在一个系统中定量检测出四种不同的DNA(cDNA)样品。通过应用分子信标做探针，JohnMK建立了检测伪狂犬病病病毒，非洲猪瘟病毒，．猪圆环病毒2型和猪细小病毒的荧光定量PCR技术【74】。②分析基因表达的差异。Real．timePCR在转基因动物的纯合性鉴定上有用武之地；另外，监测转基因后外源基因表达量【7引。由于Real—timePCR在反应结束后不需要进行电泳观察实验结果，所以现在比较普及。⑧基因分型。Real．timePCR不仅可以对基因表达解析还可以对SNP分型解析，尤其在基因组不稳定性和基因突变分析上【76l。Sevall等学者获得了一个直接用Real．timePCR区分等位基因的方法f77】。1．4研究的目的和意义猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒被认为是引起仔猪腹泻的主要病原，这三种病毒的共同点是都能引起不同日龄猪的高度接触性腹泻，由丁．在临床症状、病理变化和流行病学上很难区分，因而在临床和组织病理学上十分相近：引起类似的组织损伤，即通过小肠上皮细胞的损伤而引起肠绒毛萎缩，最终导致水样腹泻和呕吐，饲料转化率降低，经济严重损失。感染PEDV和TGEV的哺乳仔猪，致死率很高(30—80s$I100％)；引起仔猪散发性腹泻的主要病原就是PoRV，致死率低，但与致病性人肠杆菌混合感染，会导致严重经济损火。本研究针对三种病毒保守区设计特异性引物，通过摸索适宜的条件和样品用量，建立可以同时检测三种常见病毒的多重PCR方法和Real．timePCR方法并初步应用于临床诊断，为猪病毒性腹泻的流行病学调查及诊断与防制提供了基础。12 材料与方法2．材料与方法2．1实验材料2．1．1病毒及临床样品PEDV-TGEV-PoRV三联灭活疫苗(批号22101)购白四川省华派生物制药有限公司；PEDV(LIB／03株)和TGEV(OM98株)和PoRV(JL94株)由本实验室保存；20份腹泻猪的粪便病料分别采白黑龙江和内蒙等地的不同规模化猪场。2．1．2主要试剂DNAMarl【erDL2000、DLS000、RNA酶抑制剂及dNTPMixture均购白TaKaRa公司；THUNDERBIRDSYBR@qPCRMix均购白TOYOBo公司；M—MLVRnse购臼Promega公司，Trizol试剂和DEPC购臼Invitrogen公司，pMDl8-T载体和人肠杆菌JMl09感受态由本实验室保存。2．1．3引物设计与合成参考GenBank中登录的PEDV(AF353511．1)、TGEV(AF302263)、PoRV(L29186．1)参考株基因序列，利用软件Primer5．0设计合成3对特异性引物，上海生iL生物：【程技术服务有限公司合成。表2-1多重PCR引物序列Tab．2-1SequencesofthemultiplexPCRprimers参考GenBank中登录的PEDV(NC003436)、TGEV(AJ271965)、PoRV(JX498948)参考株基因序列，利川软件Primer5．0设计合成3对特异性引物，由上海生j【：生物j【|程技术服务有限公司合成。13 东北农业大学硕士学位论文表2—2荧光定量PCR引物序列Tab。2-2Sequencesofreal—timePCRprimers2．1．4病料样品的处理将发病猪场的粪便样品直接移入EP管中，经研磨器充分研磨屙，按1：1比例加入PBS缓冲溶液，将样品悬起，反复冻融3次，4。C3000r／rain离心20min，提取上清，保存在．70℃备用。2．1．4．1粪便裂解液配制的主要试剂粪便裂解液是0．05mol／LEDTANa2的PBS，本次实验配制200mL。1．69Nacl，0．049Kcl，o．z889Na2HP04，0．0489KH2P04，3．72249EDTANa2，1214C高压灭菌后备用。2．1．4．2培养液及培养基配制LB培养基：酵母提取物59，胰蛋白胨109，NaCI109，加纯水至1000mL，10mol／LNaOH调pH至7．5，液体培养基中加入琼脂即为LBl刮体培养基，进行高压灭菌，4。C保存备用。2．1．4．3其它主要试剂lmg／mL溴化乙锭(EB)溶液：称取EB0．29于棕色试剂瓶内，按lOmg／mL的浓度加纯水20mL，轻微震荡使之溶解，吸取溶液2mL于另一棕色试剂瓶内，加入18mL水至20mL，轻轻摇匀即可。TAE缓冲液(50×贮存液)：400mL纯水溶解"Iris．Base121．a49，冰乙酸28．55mL及9．39EDTA，调pn8．0，加纯水定容至500mL。2．1．5主要仪器设备低温台式高速离心机：ThermoLegendMicRO17电热恒温培养箱：DK-8D型，上海精宏实验设备有限公司梯度PCR仪：GeneAmpPE240014 材料与方法超净l：作台：FromaScientific1829．SN．17069．15DNA电泳仪：BioRadMAl20型MINIVERITICALGELSYSTEM电热恒温水槽：DK-80型，上海精宏实验设备有限公司恒温水浴摇床：HZS-D型，哈尔滨市尔联电子技术开发有限公司紫外分光光度计：UV-120．20型，岛沣公司微量电子大平：ME'ITERAE260型，Deltalange公司涡旋震荡器：H．1型，上海泸西仪器厂凝胶成相仪：UVR．800Uitra．UioletProcductsLimtedCambladgeUK2．2实验方法2．2．1单一病原体基因PCR扩增及测序在无菌超净台内取粪便样品标号称重，加入粪便裂解液，涡旋振荡3min，4。C离心机600r／min，3000r／min，12000r／min各离心5min，取500／llL上清，向上清中加入500／tLTrizol振荡2min，冰上静置10min，4。C离心12000r／min离心5min，取上清加入400／tL哥罗仿，振荡混匀，冰上静置10rain，40C离心12000r／rain离心6rain，取上清加入等量的异丙醇，．40。C沉降过夜，冻物融化，46C离心12000r／rain离心5rain，尽弃上清，自然风干，川75％乙醇洗一次，4。C离心12000r／min离心6min，尽弃上清，自然风干，用20／lLDEPC水溶解，加入各0．瓤L下游引物(分别是0．5，uLPD2、0．5。uLTD2、0．5／．tLRD2)，75"C水浴10min，冰浴5min，反转录反应体系如_卜．(单位“L)：反应总体积5xMLVBufferdN，rPMixDEPCH，OM．MIⅣIH．a∞RNaseRibonucleaseInhibitor1884321反应条件为：42"C水浴1h，70℃灭活15min，冰浴5min。以阳性对照病毒RNA转录获得的eDNA为模板，分别用3对引物，作单对引物扩增。反应条件：PEDV预变性95℃5rain；变性94℃30s，退火53"(230s，延伸72℃lmin，35个循环：终延伸72℃10min。TGEV预变性94"C5rain；变性94。Clmin，退火51"C30s，延伸72"Clmin，35个循环；终延伸72℃10min。PoRV预变性94。C5min：变性94。Clmin，退火53"C30s，延伸72。Clmin，35个循环；终延伸72℃10min。15 东北农业大学硕士学位论义反应体系如‘卜．(单位∥L)：反应总体积25H201510xBuffer2．5dNTPMix2上游引物(PDl、TDl、ROi)1下游引物(PD2、TD2、Im2)1rTaq0．5模板cDNA3称取O．159琼脂糖溶于15mL1×TAE缓冲液中，微波炉加热溶解后冷却至50"C一60。C左右，加入lmg／mL溴化乙锭(EB)溶液至终浓度为0．05％，摇匀，再将其倒入准备好的凝胶板中。待胶凝同后，在加样孔分别加入5／丝LPCR产物样品和DL2()00DNAMarker样品，90V电压电泳20min左右后，在紫外检测仪下观察电泳结果。2．2．2多重RtPCR扩增将PEDV-TGEV-PoRV三联灭活疫苗获得cDNA为模板进行扩增，扩增体系为10xPCR。bu&r2．5∥L，d^rrPs(2．5mm01／L)2∥L，上游引物各0．5／比L(PDI+TDI+RDl)：下游引物各3‘0．5．uL(PD2+TD2+RD2)，rTaq(5U／I,tL)O．靴L，去离子水14／比L，cDNA模板私L。反应条件：95。C5min；94。C30s、53。C45s、72"Clmin，共35个循环：72。C10min。2．2．3PCR产物的回收进行胶回收PCR样品反应体系如下(单位皿)：反应总体积50去离子水2910xEx-TaqBuffer5dNTPMix4上游引物(PDl、TDl、lml)2‘F游弓I物(PD2、TD2、RD2)2Ex-Taq1模板cDNA7PCR产物与10％的10xLoadingbuffer混合上样，IOOV电泳大约20min，电泳完成后在长波紫外灯下切割获得目的基因，采用DNA纯化回收试剂盒{中科瑞泰(北京)生物j【：程有限公司}进行胶同收：具体操作如下：按每100mg琼脂糖加入300／比L的DB液体，56"C水浴10min，每2-3min颠倒混匀一次，使凝胶完全溶解；按每lOOmg凝胶加入15叻L的异丙醇，振荡混匀，将溶解的凝胶液移至吸附柱，12000r／min离心lmin，倒掉收集管中的废液，再将吸附桴放入相同的收集管中；在吸附柱中加入700／tL漂洗液WB，12000r／min离心16 材料与方法lmin，去除收集管中的废液，再将吸附柱放入相同的收集管中，在吸附柱中加入500／【lL漂洗液WB，12000r／min离心lmin，去除收集管中的废液，再将吸附柱放入相同的收集管中，12000r／min离心2min；将吸附柱放入一个沽净的1．5mL的EP管中，在吸附膜的中央位置加入3舡L去离子水，室温放置2min后，12000r／min离心lmin，取纯化的DNA样品，进行1％琼脂糖电泳，观察纯化的PCR产物。2．2．4目的基因片段与pMDl8．T载体的连接采用胶同收的样品进行连接pMDl8-T载体连接反应体系如下(单位gL)：总体系10纯化的PCR产物5SolutionI4．5pMDl8-Tvector0,5一混匀后，将连接管置于连接仪中16℃连接4h以上；将连接产物转化到JM．109感受态细胞。2．2．5大肠杆菌JM．109感受态的制备@LB(无抗性)溶液，EP管，吸管，50mL离心管需．20℃预冷。②挑菌至摇菌管中的火肠杆菌摇菌过夜后接菌，1：100倍稀释，一般2h左右(500／比L的摇过夜菌液接种‘T50mL装LB的锥形瓶中)，37"C摇床摇90min．2h左右。③测菌液OD值，达到0．4以上即可，比色皿l号LB液，2号3号为两锥形瓶内菌液，Hj分光光度计测OD值。④OD值达到0．4以上的两个锥形瓶菌液，水浴10rain，此后操作为低温操作。⑤菌液至两个人EP管中，配平，4"C3500r／min离心10rain(大离心机需提前预冷至4"C)，此时Cacl2溶液冰浴。⑥倒上清，J{j10mE吸管吸取10mLCacl2加在大离心管中，轻柔低温吹打。⑦4℃离心机3500r／min离心10rain，然后加入10mLCacl2吹打，冰浴10min。⑧4℃离心机3500r／min离心10min，然后加入2mLCacl2轻柔吹打，使菌体混匀。⑨用吸管分装菌液在1．5mLEP管中，-8012保存。2．2．6连接产物的转化从．8012取出感受态细胞JM．109，冰上使其缓缓融化，取之前连接产物10／比L与感受态细胞JM．109混合，冰上作用30min，42℃作用90s，迅速放置冰浴5min，无菌条件下加入无抗生素LB液体培养基50(01，37"C温和震荡培养40-60rain，无菌条件一卜．将300，uL混合体系平均分散在含Amp+的LB琼脂平板，37"(2温箱培养10h。2．2．7pMDl8．T基因重组质粒的鉴定17 东北农业大学硕士学位论文在LB培养基上挑出白色菌落置丁．5mL含10／d．Amp+的LB液体培养基中，37。C振荡培养过夜，按中科瑞泰(北京)生物科技有限公司DNA提取纯化操作的方法提取质粒。取1．5mL细菌培养物，4。C12000r／min离-11,lmin，尽可能去除上清液；向菌体沉淀的离，11,管中加入25叻L的溶液P1，利用涡旋振荡器使细菌沉淀悬浮：向其加进25毗L溶液P2，温利地上卜．颠倒6—8次使菌体彻底破碎；再向其添加35吮L溶液P，，马上缓f曼地上卜^颠倒6．8次，均匀混合，轻轻地将上清移置吸附柱CP里，4"C12000r／rain离一Ii,lmin，去除收集管中的废液，把吸附柱CP放入相同的收集管里；继续向吸附柱CP中加入700pL漂洗液PW，12000r／min离，11,lmin，去除收集管中的废液，再将吸附柱CP重新放同相同的收集管中；在吸附柱中CP加入5009L漂洗液PW，12000r／min离，11,lmin，去除收集管中的废液，继续将吸附柱放入相同的收集管中，12000r／min离心2min；将吸附柱CP放入一个沽净的1．5mL的离一11,管里，在吸附膜中间位置滴加70／tL去离子水，室温放置儿分钟后，12000r／rain离心2min，即已提取质粒完毕，-20℃保存备用，进行质粒PCR。质粒PCR反应体系如下(单位肛L)：反应总体积25H2017．510xBuffer2．5dNrrPMiX2上游引物(PDl、TDl、RDl)1下游引物(PD2、TD2、RD2)1Taq-HS0．5质粒0．5反应条件：PEDV预变性95℃5min；变性94"C30s，退火53。C30s，延伸72。Clmin，35个循环；终延伸72℃10min。TGEV预变性94。C5min；变性94℃lmin，环；终延伸72℃10rain。PoRV预变性94。C5min；变性94"Clmin，环：终延伸72℃10min。退火51"C30s，延伸72℃lmin，35个循退火53"C30s，延伸72。Clmin，35个循称取O．159琼脂糖溶解在15mLlxTAE缓冲液中，微波炉加热溶解后冷却至50"C-60"C左右，加入溴化乙锭(EB)溶液至终浓度为0．05％，摇匀，将其倒入准备好的凝胶板中。待凝胶凝固后，在加样孔分别加入靴LPCR产物样品与6xLoadingbuffer和DL2000DNAMarker样品，90V电压电泳20min后，在紫外检测仪下观察电泳结果。对重组质粒进行单酶切，双酶切鉴定。单酶切、双酶切鉴定的反应体系(单位ⅣL)：单酶切体系反应总体系重组质粒ddH201053．5双酶切体系反应总体系重组质粒10xKBuffer1820152 材料与方法10xBuffer2ddH20、2BamHI／HinIll0．5BamHl0．5——————Hindlll0．5单双酶切前须在涡旋振荡器振荡，37。C酶切2h反应结束后，取跏L产物10xLoadingbuffer和DIA500DNAMarker进行1％琼脂糖凝胶电泳，分析结果。2．2．8测序及结果分析将刚性重组质粒pMD．18．T-M送至上海英骏生物技术有限公司北京测序部测定序列，并采用DNAMAN软件进行序列分析，与Genbank上已经报道的基因序列进行核苷酸及氨基酸序列同源性比较。2．2．9多重PCR扩增条件的优化对多重PCR中的退火温度(50．8℃、51．7℃、52．6"C、53．5℃、54℃、55．I。C)、各引物对终浓度(pmol／／【lL)组合(0．4、0．4、0．4；0．6、0．6、0．6；0．8、0．8、0．8；1．0、1．0、1．0；)等反应条件进行优化，筛选出多重PCR扩增最佳反应条件。2．2．10特异性试验以PEDV．TGEv．PoRv三联灭活疫苗、HCV、PRV等病原体的核酸为模扳，进行同等条件下PCR扩增，反应结束后，取2,uLPCR样品在1．5％琼脂糖凝胶上进行电泳并分析结果。2．2．11敏感性试验将疫苗株刚性对照cDNA以2倍浓度梯度稀释为基准，用去离子水进行稀释，并在紫外分光光度计测定其核酸浓度，分别以各浓度梯度为模板，按条件优化好的多重PCR反应条件进行扩增。反应完毕，取29LPCR样品在1．5％琼脂糖凝胶上电泳并进行结果分析。2．2．12重复性试验按照2．2．1的方法提取PEDV感染的5份刚性样品、TGEV感染的5份阡l性样品、PoRV感染的5份阳性样品以及5份阴性样品的基因组RNA，用建立的多重RT-PCR检测技术进行PCR扩增，重复检验多次，以保证本技术的重复性和稳定性良好。2．2．13临床感染病料的检测对本实验采集的来自黑龙江和内蒙等地的20份送检疑似病料提取基因纽RNA，进行多重RT-PCR检测，琼脂糖凝胶电泳观察检测结果。2．2．14荧光定量PCR标准品的制备及标准曲线的建立(1)PEDV标准曲线的建立用分光光度计测定PEDV重组质粒的OD260值，依据公式计算出拷贝数。然后作梯度稀释，浓度分别为：3．3x108、3．3x107、3．3x106、3．3x10s、3．3x104、3．3x103、3．3xl&、19 东北农业火学硕jl：学位论文3．3x101copies／／丛L。荧光定量PCR反应体系为20／l‘L：灭菌ddH20水6．7即L，上、卜．游引物各0．印L，THUNDERBIRDSYBR@qPCRMixl2．跏L，50xRoxreferencedye模板1．毗L。荧光定量PCR反应条t'1：：95。C10s，95。C5s，61。C20s，40个循环。(2)TGEV标准曲线的建立川分光光度计测定TGEV重组质粒的OD260值，依据公式计算山拷贝数。然后作梯度稀释，浓度分别为：3．2x108、3．2x107、3．2x106、3．2x105、3．2x104、3．2x103、3．2x102、3．2x101copies／／比L。荧光定量PCR反应体系为20／【lL：灭菌ddH20水6．7舡L，上、下游引物各O．即L，THUNDERBIRDSYBR@qPCRMixl2．靴L，50xRoxreferencedye模板1．叻L。荧光定量PCR反应条件：95。C10s，95。C5s，61。C20s，40个循环。(3)PoRV标准曲线的建立用分光光度计测定PoRV重组质粒的OD2∞值，依据公式计算出拷贝数。然后作梯度稀释，浓度分别为：2．8x108、2．8x107、2．8x106、2．8x105、2．8x104、2．8x103、2．8x102、2．8x101copies／ⅣL。‘荧光定量PCR反应体系为20#L：灭菌ddH20水6．7印L，上、’卜．游引物各0．即L，THUNDERBIRDSYBR@qPCRMixl2．5ⅣL，50xRoxreference、dye模极1．q“L。荧光定量PCR反应条件：95。C10s，95℃5s，61。C20s，40个循环。2．2．15荧光定量PCR的特异性(1)PEDVSYBRGreenI荧光定量PCR的特异性依据PEDV荧光定量PCR反应过程，制备预混液，分别添加如。卜．cDNA模极：猪传染性胃肠炎病毒cDNA1／tL、猪轮状病毒cDNA1／tL、猪瘟病毒cDNAl∥L、猪流行性腹泻病毒cDNA№L、猪伪狂犬病毒cDNA1肛L，同时设立阴性对照。(2)TGEVSYBRGreenI荧光定量PCR的特异性依据TGEV荧光定量PCR反应过程，制备预混液，分别添加如‘t-cDNA模板：猪流行性腹泻病毒cDNAI∥L、猪瘟病毒cDNA1口L、猪轮状病毒cDNA1／tL、猪传染性胃肠炎病毒cDNA1∥L、猪伪狂犬病毒cDNA1J￡‘L，同时设立阴性对照。(3)PoRVSYBRGreenI荧光定量PCR的特异性依据PoRV荧光定量PCR反应过程，制备预混液，分别添加如下cDNA模板：猪传染性胃肠炎病毒cDNAI∥L、猪流行性腹泻病毒cDNA耻L、猪瘟病毒cDNAmL、猪轮状病毒cDNA毕L，猪伪狂犬病毒cDNA耻L，同时设立阴性对照。2．2．16荧光定量PCR的重复性采J=}=IPEDV、TGEV、PoRV同一批次3个不同浓度的标准品进行批内重复试验；以不同批次这3个浓度的标准品为模板，在不同时间内进行批间重复试验，采用统计学方法分析20 材料与方法实验结果，分别验证PEDV、TGEV、PoRVSYBRGreenI实时荧光定鼙PCR方法的重复与稳定性。2．2．17荧光定量PCR的敏感性浓度从108copies／／tL至101copies／gL的质粒标准品为模板，每个浓度标准品取样1．吮L，进行荧光定量PCR实验确定其敏感性。2．2．18荧光定量PCR临床样品检测抽检来自黑龙江、内蒙古等省市现地猪场粪便样品20份，应J}_l{SYBRGreenIreal-timePCR和单一PCR方法对病料同时检测。21 东北农业人学顺Ij学位论义3结果与分析3．1多重PCR扩增条件的优化结果3．1．1单一RT-PCR扩增及退火温度的优化结果以单一病原体为模板，采心不同的退火温度(50．80C．55．I。C)进行单一PCR检测，依据琼脂糖凝胶电泳条带分析；然后进行多重PCR对退火温度进行摸索，结果显示在50．80C．55．IoC之间都可以有较好的目的条带，最终试验选择53。C作为退火温度。20001000750500250100M123456000bp750bp500bp250bp100bp、l123-l56(a)、I123j56(b)(c)M．DL2000DNAMarker：a．PEDV；b．TGEV；C．PoRV；1-6．退火温度分别为50．8℃、51．7℃、52．6"C、53．5℃、54℃、55．1℃LaneM．DL2000DNAMarker；Lanea．PEDV；LaBeb．TGEV：Lanec．PoRV：Lane1-6．Optimalannealtemperatureis50．8℃，51．7℃，52．6℃，53．5℃，54℃，55．1℃图3—1单一RT-PCR扩增及退火温度优化Fig．3-1SingleRT-PCRproductsandoptimalannealtemperature 结果’j分析2000bp1000bp750bp500bp250bplOObp、Il23456M．D12000DNAMarker；1-6．退火温度分别为50．80C、51．7"C、52．6"C、53．50C、54。CLaneM．DL2000DNAMarker；Lane1-6．Optimalannealtemperatureis)50．8℃，51．7℃，52．6℃，53．5℃，54℃，55．1℃图3—2多重RT-PCR退火温度的确定Fig．3-2TheoptimalannealingtemperatureinmultiplexRT-PCR3．1．2多重RT-PCR引物浓度的优化结果琼脂糖凝胶电泳表明，PEDV、TGEV、PoRV的上、卜．引物浓度分别为0．8pmol／ML、0．8pmol／／,tL、1．0pmol／pL扩增效果最佳。、王123-l2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM．DL2000DNAMarker：1-4．PEDV，TGEV，PoRV上下游引物浓度(pmol／ML)分别为O．4、0．6、0．8、1．0LaneM．DL2000DNAMarker；Lane1-4．Theoptimalprimerconcentrationis0．4，0．6，0．8，1．0图3．3多重RT-PCR最佳引物浓度优化结果Fig．3-3TheoptimalprimerconcentrationusedinmultiplexRT-PCR3．1．3多重RT-PCR循环数的优化结果对多重RT-PCR的循环数进行摸索，进行25个循环，30个循环，35个循环。琼脂糖凝胶电泳表明，选择最佳的循环数为35个循环。 东北农业人学fi!j{Ij学位论文、l1二32000bp1000bp750bp500bp250bplOObp縻瑟萋溺l毫j麓黪二谢≯-!∞一鼍纛鼍矗I麟巍1I穆孥蟪纛：。!镳|_i_=囊蠹1艮V，一-獭麟獭睽嗣霹l譬___：二』．二：．_M．DL2000DNAMarker；1-3．循环数分别为25个，30个，35个循环LaneM．DL2000DNAMarker；Lane1-3．Theoptimalcycleis25，30，35图3-4多重RT-PCR最适循环数优化结果Fig．3-4TheoptimalcycleusedinmultiplexRT-PCR3．2特异性试验结果针对PEDVS基冈、TGEVS基冈利PoRV1096基冈进行了PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，扩增产物符合预期目的片段，PEDV的682bp，TGEV的480bp和PoRV的297bp的特异性片段，而对照扩增不山任何条带，扩增产物序列与GenBank中相应参考序列同源性均在90％以上。V：二j=了：；：’?!：00bD：0：0bu4三二b1)5：0b1≥：j：b：8CbsM：DL2000DNAMarker：1．PEDV(LIB／03株)：2．TGEV(fDl98株)；3．PoRV(JL94株)；4．PEDV+TGEV：5．PEDV+PoRV：6．TGEV+PoRV；7．PEDV+TGEV+PoRV；8．PRV：9．HCV；10．NegativecontrolLaneM．DL2000DNAMarker；Lane1．PEDV(LJB／03)；Lane2．TGEV(TH98)；Lane3．PoRV(JL94)；Lane4．PEDV+TGEV；Lane5．PEDV+PoRV；Lane6．TGEV+PoRV；Lane7．PEDV+TGEV+PoRV；Lane8．PRV；Lane9．HCV；Lane10．Negativecontrol图3—5PEDV、TGEV及PoRV多重PCR扩增结果Fig．3-5MultiplePCRamplificationresults 结果‘j分析3．3敏感性试验结果将提取的m|生核酸进行倍比稀释，并以稀释样晶作为扩增模板，试验结果说明，PEDV检测最小病毒模板浓度为3．3x103'copies／,uL：TGEV检测最小病毒模板浓度为3．2x103'copies／,uL；PcRV检测最小病毒模板浓度为2．8x103'copies／,uL。DL2000DNAMarker：1-8．倍比稀释分别是21、2。’、2一、2。、2一、2～、2～、2墙LaneM．DL2000DNAMarker；EarLe1-8．Thedilutionisz,,z％2-3,2-％2-5,2-％2-％z8图3石多重PCR灵敏性检测3．4重复性试验结果Fig．3-6SensitivityassayofmultiplexPCR选用条件优化好的多重PCR技术，分别扩增刚性对照和阴性对照，重复进行多次PCR刚性对照均能扩增得到目的条带，而阴性对照均米见扩增条带，符合预期设想；对倍比稀释的刚性样本多次进行PCR检测，结果表示样品检山。卜．限完全相同。以上结果说明建立的多重PCR方法能够得到稳定、重复性较好的结果。3．5临床样品的检测对20份在不同地区采集的疑似病料，用建立的多重PCR利单一FCR方法进行了同时检测，两者符合率达100％，结果表明建立的多重PCR反应体系的重复性较好。 东北农业人学硕l：学位论文表3．1被检病料单一PCR与多重RT-PCR检测对比试验Tab．3-1ComparisonofmultiplexPCRandPCRfordetectingclinicalsamples单--RT．PCR(PCR)多重RT—PCR(multiplexPCR)病毒———1蟊霹夏————酉雁酲r———’爵雨芽————雨酉符合率／％VirusCountsofPositiveCountsPositiveCoincidencesamplesofsamplesPEDVTGEVPoRV2012942012941003．6荧光定量PCR扩增目的片段电泳结果：：?00bD1L'：00bp：5Cb!s10钝BM：DL2000Maken1．PEDV二01R丹：2．NTCLaneM．DL2000DNAMarker；Lane1．PEDV二DRF，：Lane2．NTC图3—7PEDV咖基冈序列PCR扩增结果Fig．3-7AmplificationofPEDVORF3gene．'000bls1000bD2．：Olzp10CIbpl藿黉慈1卜镉嘲游。：。纛鬻、“嫠j‘豁j—M：DL2000Maker；1．TGEVS：2．NTCLaneM。DL2000DNAMarker；Lane1．TGEV-S：Lane2．NTC图3—8TGEVS基因序列PCR扩增结果Fig．3-8AmplificationofTGEVSgene 结果‘j分析M：DL2000Maker；1．PoRV-VP7；2．NTCLaneM．DL2000DNAMarker；Lane1．PoRV-VP7：Lane2．NTC图3-9PoRVFP7基因序列PCR扩增结果Fig．3-9AmplificationofPoRVVP796ne3．7重组质粒测序结果PEDVORF3基冈测序结果，经BLAST比对证实为PEDVORF3基冈序列，与目的序列一致。ACTTGTAATGGCCA：rACTGAAGCACTACAAGl'AGTATCGTCAGTATGAL气：ITCCATGTGAAp汀TCCAGT订CTf蚣GGTGTTCAp汀℃ACCTCArCAACGGGAAI'AGAACCGTTAGACAArI：r《：TAGAGGArCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCA_rGGTC芦m气GCTGT丌CCGTGTGAAA丌GTTATCCGCTCACA舯CCACACAACArACGAGCCGGAAGCATAAAGTGl．AAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCl’AACTCACAll'AA丌GCGTTGCGCTCACTGCCCGCT丌CCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCA丌AArGA√气TCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTrGCGl巳～TTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCTGEVS基冈部分核酸序列重组质粒测序结果如。卜．，经BLAST比对证实为TGEVS基冈部分核酸序列，与目的序列一致。AA兀CCAGTTTCTAAGGTGTTCAATCACCTCATCAACGGGAATAGAACCGTTAGACAATCT(了_rAGAGGATCCCCGGGlACCGAGCTCGAAITCGTAATCATGGTC觚～GCTGT兀CCGTGTGAAATTGTl：f气TCCGCTCACAArrCCACACAACA：rACGAGCCGGAAGCAL气AAGTGTPoRVVP7基因部分核酸序列重组质粒测序结果如下，经BLAST比对证实为PoRVVP7基因部分核酸序列，与目的序列一致。AAAGCCTGGGGTGCCl’AATGAGTGAGCE蚺CTCACArI'A／钥门’GCGTTGCGCTCACTGCCCGCTrI℃CAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCAll’AArGAArCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTITGCGTf蛔门?GGGCGCT(1TCCGCll℃CTCGCTCA(了rGACTCGCTGC3．8荧光定量PCR标准曲线27p弛渤．魄沌弛∞弼巧弼∑” 结采与分析3．9荧光定量PCR重复性试验结果(1)PEDV重复性试验结果显示PEDV重复性试验结果显示(表3·2)，3个浓度标准品批内重复变异系数(CV)分别为1．51％和1．84％矛110．39％，。批间重复变异系数分别为3．41％、2．97％3110．77％，小于5％。表3．2PEDV荧光定量PCR重复性试验数据分析Tab．3-2TheCtanalysisofreproducibilityforPEDVrealtimePCR批内重复批间重复垫!三!：!塑璺Z垫堡￡兰翌苎艺标准品(copies／／ⅡL)Standard3．3x1043．3x1033．3x1023次试验cr值ThecTvaluesof3tests12319．0119．7219．28O．2922．1023．1222．660．4123．6723．7923．900．093次试验CT值TheCTvaluesof3tests标准差变异系数％23SDCv％19．1019．6819．780．6722．1522．7022．850．6723．舳23．6823．880．183-4l2．97O．77(2)TGEV重复性试验结果显示’TGEV重复性试验结果显示(表3—3)，3个浓度标准品批内重复变异系数(CV)分别为3．18％和2．21％和0．52％，批间重复变异系数分别为3．48％、2．41％并110．37％，小于5％。表3．3TGEV荧光定量PCR重复性试验数据分析Tab．3-3TheCtanalysisofreproducibilityforTGEVrealtimePCR批内重复批间重复垫坚二!!塑Z垫!!￡璺壁垒!标准品(copies／／zL)Standard3．2xl旷3．2x1033．2x1023次试验CT值neCTv山耐3恻s霎准123SD18．5119．0119．980．61变异系数％CV％3．183次试验cr值TheCrvaluesof3tests12319．1019．1819．780．6722．6423．2622．030502．21223522．6022．950．5425．6725．9725．700．130．5225．8025．8825．78O．10变异系数％CV％3．4824lO．37变异系数％mm懈啷标准差乩标准差缸 东北农业大学硕士学位论文本实验川已建立的荧光定量PCR和常规PCR方法对收集黑龙江、内蒙等地的不同规模化猪场的病料进行平行检出，两种方法获得的结果见表3．5。在20份待检样品中，荧光定量PCR检出PEDV、TGEV、PoRV的样品数为14、10、7份，附I生率为分别为70％、50％、35％；常规PCR检出样品数分别为12、9、4份，同I性率分别为60％、45％、20％。表3．5被检病料单一PCR与荧光定量RT-PCR检测对比试验Tab．3—5ComparisonofReal-timePCRandPCRfordeleclingclinicalsamples 讨论4讨论4．1多重RT．PCR方法检测猪腹泻病毒猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪轮状病毒感染，是常见的引发猪场病毒性腹泻的主要病原体，发病率高，目前均无对症的药物，且三者共同点就是临床症状、流行病学和病理变化上有许多相似之处，是危害养猪业并给经济带来极大的损失的疾病。因此，迫切需要建立一种快速诊断的方法，能同时检测这三种病原体，PCR技术因具有快速精准、特异、灵敏等优点，目前已经有许多文献报道应用常规PCR方法检测腹泻病毒，传统PCR仅仅能够检测单一病原体，多重PCR针对多种病原微生物的同时检测，而且继承了常规PCR高灵敏性高特异性的优点，适合大规模检测。本试验通过设计分别针对PEDVS基因(682bp)、TGEVS基因(480bp)和PoRVI／P6基因(297bp)的3对引物，将PEDV．TGEV-PoRv三联弱毒疫苗作为阳性对照，对PCR反应样品含量及摸索适宜的条件扩增，建立了多重PCR方法，扩增可以得到约682bp、480bp、297bp的3条特异性条带，目的片段K度具有显著的差异，便于识别区分，扩增特异性较强，扩增效率较高，将阳性产物纯化后进行基因测序，结果显示，扩增的目的基冈与参考毒株的同源性均人丁90％，说明扩增的目的基冈序列正确。本研究可以在一份样品中同时检出3种病原体，达到对多种疾病的同时检测的目的，对于临床上PEDV、TGEV和PoRV3种病原的确诊和混合感染检测具有良好的应瑚前景，为临床上对这3种疾病的快速诊断和防控提供了保证，也因该方法的特异性强、敏感性高，可应用于临床诊断和流行病学调查。该多重RT-PCR方法检测灵敏性分别达到PEDV模板3．3x10Scopies／／比L、TGEV模板3．2x103copies／／【￡L和PoRV模板2．8x103copies／gL。应用20份临床病料来自黑龙江和内蒙古等地，其中12份PEDV阿l性，I‘i60％；9份TGEV阳性，l!i45％；4份PoRV，Ioi20％；本研究对多重RT-PCR和单一RT-PCR方法进行对比验证，结果显示，两者的总符合率为100％178】。2006年杨群等学者应用PCR方法对我国多个省市158份粪便样品进行检测，结果表明TGEV刚性率达到22．8％1791；2010年张坤等学者对华中地区75份样品进行PCR检测结果表明，TGEV阳性率达到0．53％1s01，然而在2012年的8l份样品中均朱检出TGEV阡{性病料，表明在华中地区感染TGEV的情况较少。通过对这些检测结果的比较分析，进一步证明了PCR方法应用病毒性腹泻检测的准确性和可靠性，尽可能应用该方法检测三种病原体，以致迅速采取防控措施。4．2检测猪腹泻病毒的荧光定量PCR方法分析由于SYBRGreenIreal．timePCR反应中设计引物的要求比较复杂，引物内不能出现反向重复序列，不能形成发夹二级结构，同时也不能产生引物间配对形成引物二聚体。本实验根据GenBank上登录的PEDVCV777毒株(NC003436)、TGEV(AJ271965)、PoRV35 东北农业火学硕士学位论文(JX498948)的全序列，分别以其PEDVORF3基因(103bp)、TGEVS基冈(115bp)、PoRVVP7基冈(153bp)设计荧光定量PCR引物，扩增产物长=度分别为103bp、115bp、153bp。扩增的产物与亲本序列进行BLAST比对，同源性为100％。实验结果证实PEDV标准品在3．3x106-3．3x102copies／／,tL范围内的标准曲线线性关系较好，相关系数为0．992902，扩增效率为0．93；TGEV的标准品在3．2x106-3．2x102copies／／tL范嗣之间可以得到线性关系较好的标准曲线，相关系数为0．987209，扩增效率为0．99；PoRV的标准品在2．8x106．2．8×102copies／gL范围内的标准曲线线性关系较好，相关系数为0．999045，扩增效率为1．15。重复性试验结果表明这三种方法的批内批间变异系数都小于5％。敏感性试验结果显示，PEDV、TGEV、PoRV荧光定量PCR方法的最低检测下限分别为33copies／／比L、32copies／／,tL、28copies／／llL。2004年Chen等建立了基于LUX引物的real—timePCR应用在检测猪传染性胃肠炎的方面，与单一的PCR技术相比，其检测的灵敏性提高了10倍【811，2008年徐丽秋等学者根据TGEVN基因的保守序列设计引物和探针，建立了一种特异高、灵敏高、便捷的荧光定量PCR方法，与单一的PCR技术相比，其灵敏性提高了100倍【82l，国外一些学者也建立了检测猪流行性腹泻的荧光定量PCR方法【83．84】。SYBRGreenIreal．timePCR方法与TaqMan探针法相比，更加简便，仅仅需要在SYBRGreenI预混液中加入引物和模板，价格低廉，无需合成探针而且花费很高。SYBR()reenIPCR与单一PCR相比，优点就是扩增和检测同时完成，无需后续的电泳检测，避免了污染问题，而且操作更简单易行，消耗时间短，是一种快速、准确检测病原体方法，可川丁临床病原体感染检测。本研究建立了PEDV、TGEV、PoRVSYBRGreenIreal—timePCR检测方法，并刚丁．检测临床腹泻样品，结果显示方法的特异性强、重复性好、敏感性高等，适用于这三种病原体的定性与定量分析。用荧光定量和单一PCR两种方法对黑龙江、内蒙等地猪场的20份粪便样品进行检测，PEDV阳性率分别为70％和60％，两种方法的符合率为90％；TGEV刚性率分别为45％乘150％，两种方法的符合率为95％；PoRV阳性率分别为20％和35％，两种方法的符合率为85％。同时试验结果显示，比单一PCR方法相比，本实验建立的SYBRGreenI荧光定量方法敏感性要高，最少检出量可以达到101copies／／瞄L，对于临床上早期感染以及冈病毒含量较低不产生临床症状，本研究为此提供了简单便捷的方法。 结论5结论5．1建立了检测PEDV、TGEV、PoRV的多重PCR方法本研究根据GenBank登录的PEDVS基因、TGEVS基因和PoRVVP6基冈序列保守区设计合成引物，建立了RT-PCR多重快速检测方法。扩增PEDVS基因(682bp)、TGEVS基因(480bp)、PoRVVP6基因(297bp)，反应体系为总体积25#L，Taq酶(SU／pL)O．和L，引物量(PEDV1．0pmol／／比L、TGEV0．SpmoUltL、PoRV0．8pmol／／zL)0．助L，35个循环，总反应时间94rain，该方法检测灵敏性分别为PEDV模板3．3x103copies／／生L、TGEV模板3．2x103copies／／比L和PoRV模板2．8x103copies／／“L。5．2建立了检测PEDV、TGEV、PoRV荧光定量PCR方法针对PEDVORF3基因(103bp)、TGEVS基因(115bp)、PoRVVP7基冈(153bp)的保守区设计引物，分别建立了检测PEDV、TGEV、PoRV的SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法，二种方法的批间批内变异系数均小于5％；最低检测。卜．限分别为33copies／／比L、32copies／／．tL、28copies／／比L。5．3临床样品的检测在20份待检样品中，荧光定量PCR检出PEDV、TGEV、PoRV的样品数为14、10、7份，刚性率为分别为70％、50％、35％；常规PCR检出样品数分别为12、9、4份，阿l性率分别为60％、45％、20％，两者阳性符合率分别为90％、95％、85％37 致谢致谢能够成为李一经老师的学生我感到很幸运，时光如白驹过隙，但师生之情会永久深远。在本论文的完成过程中首先感谢的是我的导师李一经教授，在他的悉心指导卜．得以顺利完成。从论文的选题、方案的确定与实施、实验的进行、以及论文的构思与撰写，都得到了老师莫人的帮助。导师敏锐的科研洞察力、勤奋创新的科研精神、严谨求实的治学态度无不满移默化地影响着我，激励着我不断奋发向上，老师的教诲和启迪必将使我终身受益。深深的感谢您在研究生期间对我学术上的培养及在生活上给予我无私的关怀和帮助。学生无以为报，唯有今后在科研道路上继续求索，在：f作岗位上尽职尽责，为科教事业奉献自己的微薄之力来回报伯乐的知遇教之恩!在我的研究生生活即将结束之际，谨向培育我、教导我、帮助我的导师表示最诚挚的谢意!实验能够顺利进行我特别感谢实验室的其他老师的帮助，唐丽杰老师、刘敏老师、乔薪媛老师、姜艳平老师、崔文老师及师兄师姐们的帮助张博师哥、谢小冬师哥、尹纪元师哥，在我开始进入实验室时给了我很大帮助，因为刚进实验室不懂得太多了，是他们传授了我许多实验技巧和方法，使我在理论和操作方面都学到了很多，为我以后的实验打卜．了基础。师弟师妹们也在我的实验过程中给了很火的帮助，在实验窒各位同学的无私帮助‘卜-使我的论文得以顺利完成。在论文完成期间，得到研究生学院和动物医学学院的各位领导和老师给予的支持和帮助，在此深表感谢!特别感谢我的家人、朋友在生活上和精神上对我学业的全力支持，他们无微不至的关爱是我论文顺利完成的坚强后盾，他们永远是我前进的强大动力!值此论文完稿之际，谨向所有关心我、支持我、帮助我的老师、同学、亲人和朋友们献上我最真挚的感谢和最美好的祝愿! 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