猪细小病毒sybr green i荧光定量pcr诊断试剂盒的研制

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1、猪细小病毒SYBRGreenI荧光定量PCR诊断试剂盒的研制余波，周思旋，谭诗文，徐景峨，史开志，杨莉（贵州省畜牧兽医研究所，贵阳５５０００５）摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪细小病毒ＶＰ２基因序列设计特异性的引物，ＰＣＲ扩增获得猪细小病毒ＶＰ２基因片段，并克隆到ｐＭＤ－１８Ｔ载体上作为阳性标准品。通过对ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化，建立了猪细小病毒的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光定量ＰＣＲ诊断方法，以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现１个单特异峰，无引物二聚体，对ＰＲＶ、ＰＣＶ－２、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ均无阳性信号扩增，可重复性好，测灵敏度可达１

2、．０×１０１拷贝／μＬ。结果表明，研制的猪细小病毒ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点，适合于猪细小病毒临床样品的检测。..关键词：猪细小病毒；ＶＰ２基因；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光定量中图分类号：Ｓ８５２．６５＋９．１文献标识码：Ａ：０４３９－８１１４（２０１５）０１－０126－０4ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０33DevelopingＡＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲＫｉｔｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉngｏｆＰＰＶＹＵＢｏ，ＺＨＯＵＳｉ－ｘｕａｎ，ＴＡＮＳｈｉ－

3、wｅｎ，ＸＵＪｉｎｇ－ｅ，ＳＨＩＫａｉ－ｚｈｉ，ＹＡＮＧＬｉ（ＧｕｉｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：BasedonｔｈｅＶＰ２ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰＰＶｉｎＧｅｎＢａｎｋ，ｏｎｅｐａｉｒｓｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｆｏｒａｍｐｌｉｆｙｉｎｇｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＶＰ２ｇｅｎｅ．ＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＶＰ２ｇｅｎｅｏｆＰＰＶｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＭＤ－１８Ｔｖｅｃｔｏｒａｎｄｕｓｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖ

4、ｅｓｔａｎｄａｒｄ．Ａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚingａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｐｒｉｍｅｒｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ａＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓlyｄｅｔｅｃｔｉngＰＰＶ．ＴｈｅｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｄｙｅｓｈｏｗｅｄｏｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｅａｋ.Nｏｐｒｉｍｅｒ－ｄｉｍｅｒｓｐｅａｋｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ.NｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＰＲＶ，ＰＣＶ－２，Ｅ．ｃｏｌｉ，ＣＳＦＶ，ＰＲ

5、ＲＳＶwithｔｈｅＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＲｅａｌ－ｔｉｍｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＴｈｅＰＣＲｋｉｔｗａｓｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅto１．０×１０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬＤＮＡ．ItisｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＲｅａｌ－ｔｉｍｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｋｉｔｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｗｉｔｈｇｏｏｄｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ.IｔｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＰＰＶｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰＰＶ；ＶＰ２ｇｅｎｅ；ＳＹＢＲgｒｅｅｎＩｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔqｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ收稿日期：２０１４－０

6、９－２９基金项目：贵州省农业攻关项目［黔科合ＮＹ字（２０１０）３０８５］；贵州省畜禽健康养殖技术创新能力建设项目［黔科合院所创能（２０１０）４００４］简介：余波（１９８１－），男，四川邻水人，副研究员，硕士，主要从事兽医分子生物学研究，（）１５０８５９１６６６１（电子信箱）ｙｕｂｏｎｋｙ＠１６３．ｃｏｍ；通信，谭诗文（１９５６－），男，研究员，主要从事兽医分子生物学研究，（电子信箱）ｓｗｌｅｉｄｅｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。猪细小病毒（Ｐｏｒｅｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＰＰＶ）是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原体之一，可导致母猪流产、死胎，给养猪业造成了巨大的经济损失［１－３］。目前，对该病的诊断

7、方法包括传统的病毒分离鉴定，以及血清学诊断方法，如ＥＬＩＳＡ、胶体金等。常规的ＰＣＲ主要用于病死猪组织样本的检测，然而ＰＰＶ常呈长期低剂量隐性感染，常规的ＰＣＲ不仅无法对血清样本中的病毒进行定量检测，而且扩增反应后需要电泳检测，操作繁琐。荧光定量ＰＣＲ是与常规ＰＣＲ比较，具有重复性好、灵敏度高、能够定量等优点，已经被广泛应用于多种疾病病原的检测［４，５］。本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪细小病毒ＶＰ２