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1、犬钩端螺旋体病PCR和荧光定量PCR诊断试剂盒的研制PreparationofPCRandFluorescentQuantitativePolymeraseChainReactionkitfortheDiagnosisofCanineLeptospirosis作者姓名：龚悦领域（方向）：兽医指导教师：丁壮教授类别：兽医硕士答辩日期：2015年6月3日基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（201303042）国家自然科学基金资助项目（31201925）中文摘要犬钩端螺旋体病PCR和荧光定量PCR诊断试剂盒的研制钩端螺旋体病（简称钩体病）
2、，是因感染具有致病性的钩体所引起的一种人兽共患病。犬钩端螺旋体病，是由常见对犬致病的犬型、黄疸出血型、塔拉索夫型等钩体所引起。犬对该病具有易感性，犬感染本病后，临床表现多样，不易进行诊断，因此需要实验室检测对本病进行辅助的鉴别诊断。常见实验室诊断方法有直接镜检，分离培养，血清学检测，动物接种等，但这些方法或不具备时效性，或缺乏准确性。相较于这些方法，聚合酶链反应（PCR）方法更省时省力，特异性和敏感性优异，并且可用于钩体病的早期诊断。本实验依据仅致病性钩端螺旋体含有的LigB基因序列的保守片段，并对常见对犬致病的钩体株的相关序列进行比对，设计
3、了数对特异性的引物和探针，目的片段大小为124bp。对探针和引物进行筛选及反应条件与体系的优化，构建了含目的基因的质粒作为标准阳性对照，并对质粒进行测序验证。建立了犬钩端螺旋体病PCR和荧光定量PCR诊断方法，并组装成可实现对犬钩体病进行快速高效诊断的试剂盒。对试剂盒的灵敏度、特异性、重复性等参数进行了检验，确定其保存条件和保存期,采集并检测临床犬血液和尿液样本，与显微凝集试验相比较，结果一致。近年来，宠物犬的数量不断增加，各类工作犬的数量也有上升。犬易感钩体病，影响犬自身及其主人的健康，该检测方法可推广应用于犬钩体病的早期检测，避免该病的进
4、一步发展和扩散。钩端螺旋体的培养需要数周的时间，培养基的配制程序复杂，而诊断钩体病的金标准方法MAT，需要活体钩体才能进行诊断，因而很难得到推广和应用，而PCR方法不需要进行钩体的培养，并且相比于血清学方法，还可用于钩体病的早期诊断。在该实验中，建立的普通PCR方法检测钩体浓度的灵敏10度可达到10，荧光定量PCR方法的灵敏度可达10。关键词：犬钩端螺旋体病，诊断，PCR，荧光定量PCR，试剂盒IAbstractPreparationofPCRandFluorescentQuantitativePolymeraseChainReactionk
5、itfortheDiagnosisofCanineLeptospirosisLeptospirosisisazoonosiscausedbytheinfectionofpathogenicLeptospira.CanineleptospirosisiscausedbyLeptospirathatusuallyinfectCanine,asicterohemorrhagic,L.canicola,L.tarassovietc.Dogshaveasusceptibilitytothisdisease,dogsinfectedwiththisdis
6、easehasvariousclinicalmanifestations,diagnosisisdifficult,soweneedtodiagnosethisdiseasebylaboratorytesting.Commonlaboratorydiagnosismethodsare:thedirectmicroscopicexamination,isolation,serologicaltest,animalinoculation,butthesemethodsneedalotoftimeorlackaccuracy.Comparedwit
7、hthesemethods,polymerasechainreaction(PCR)methodismoretime-saving,hasexcellentspecificityandsensitivity,andcanbeusedforearlydiagnosisofleptospirosis.AccordingtotheconservativefragmentofLigBgenewhichonlyappearedonpathogenicLeptospira,andcomparewiththecommonrelatedsequencesof
8、pathogenicLeptospirastrainsthatusuallyinfectcanine,wedesignedpairsofspecific,objec
