鸡马立克氏病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、第31卷第4期四川农业大学学报Vo1．31No．42013年12月JournalofSichuanAgriculturalUniversityDec．2013doi：10．3969／j．issn．1000—2650．2O13．04．013鸡马立克氏病毒SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立程洋，冯泽清，杨辉林，刘益平，朱庆(四川农业大学动物科技学院，四川雅安625014)摘要：【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测鸡马立克氏病病毒(MDV)的SYBRGreenI实时荧光定量检测方法。【方法】针对

2、马立克氏病毒特异的Meq基因序列设计引物，利用SYBRGreenI染料建立检测马立克氏病毒的实时荧光定量PCR方法，进行敏感性、特异性、重复性试验，并应用该方法检测了罗曼蛋鸡、AA肉鸡、二郎山山地鸡SD02和SD03品系4种鸡只感染组和对照组样本的脾、法氏囊、胸腺等组织中的病毒拷贝数。【结果】该方法建立的定量标准曲线荧光阈值循环数(Thresholdcycle，Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r一0．996)，扩增效率(E)为96，熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性，敏感性和重复性试验证明该方法

3、具有较高的灵敏度和稳定性，最低检测浓度为10拷贝／L。同时运用该方法对试验样本进行检测，结果显示在4个感染组鸡只的肝，脾，肾，胸腺，法氏囊组织中均检测出Meq的拷贝，并计算出了待测样品的病毒拷贝数，相反在未感染组却没有检测出任何Meq的拷贝。试验结果还发现二郎山山地鸡两品系各组织中MDV的拷贝数显著低于AA肉鸡和罗曼蛋鸡各组织。【结论】建立的检测方法能够快速检测马立克氏病毒，结果准确，成本低廉，可以将其作为生产上监控马立克氏病的一个重要手段。关键词：马立克氏病毒；Meq基因；SYBRGreenI实时荧光定量

4、PCR；检测中图分类号：$831．7；$858．31文献标志码：A文章编号：10002650(2013)04—0427—06EstablishmentofReal-timeFluorescentQuantitativePCRforDetectingMarek'sDiseaseVirusBasedonSYBRGreenICHKNGYang，FENGZe—qing，YANGHui—Iin，LIUYi—ping，ZHUQing(CollegeofAnimalScienceandTechnology，Sichuan

5、AgriculturalUniversity，Yaan625014，Sichuan，China)Abstract：【Objective]TodevelopaSYBRGreenIreal—timefluorescentquantitativePCRassayfordetectingMarekSdiseasevirus(MDV)rapidlyandaccurately．【Method]SpecificprimersweredesignedaccordingtotheMeqgeneofMarekSdiseasev

6、irus．ASYBRGreenIreal—timeflu—orescentquantitativePCRassayfordetectingMDVwasestablishedwithitssensitivity，specifici—ty，repeatabilitydetermined．ThenwemeasuredthecopynumberofMarekSdiseasevirusbe—tweentheMDV—infectionchickensandthenormalchickensbyusingthismeth

7、od．[ResultslTheresultsshowedgoodlinearrelationshipbetweenthethresholdCycle(Ct)ofthequantitativestandardcurveandthecopynumberoftemplate(r一0．996)，andtheslopeandtheamplificationefficiency(E)oftheMeqgene(一3．433and96，respectively)．Thedetectionsensitivitywas102c

8、opies／u1．Thistesthadgoodrepetition，samplesweredetectedsuccessfully．ItshowedthatthecopynumberofMDVhadbeendetectedinliver，spleen，kidney，thymusandbursaoffabri—ciousofMDV—infectedchickens．buttherewasnotanyamplifi