基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌-论文.pdf

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1、第35卷第3期渔业科学进展V01．35．No．32014年6月PROGRESSINFISHERYSCIENCESJun．，2014基于基因的SYBRGreenI实时定量PCR检测病原灿烂弧菌于永翔王印庚刘智超，廖梅杰张正荣小军。李彬战文斌(中国海洋大学水产学院，青岛266100)(农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛266071)摘要灿烂弧菌Vibriosplendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌，对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物，建立了SYBRGreenI实时定量PCR检测灿烂弧茵的方

2、法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品，进行SYBRGreenI实时定量PCR，在为62℃时，扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰，扩增所得标准曲线为Y=一3．338x+37．67，相关系数为0．999，扩增效率为O．99，最低能检测到20个拷贝。实验结果表明，该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性，对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。关键词基因；灿烂弧茵；实时定量PCR；SYBRGreenI中图分类号$963．7文献标志码A文章编号1000—7075(2014)03—0134—09Developmentofareal·timePCRmethodfor

3、thedetectionofVibriosplendidusbasedongyrBgeneYUYong—xiangWANGYingengLIUZhi．chao，LIAOMei-jieZHANGZhengRONGXiao．junLIBinZHANWen．bin(CollegeofFisheries，OceanUniversityofChina，Qingdao266100)(KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries，MinistryofAgriculture；YellowSeaFisheriesResear

4、chInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Qingdao266071)ABSTRACTVibriosplendidusisadeleteriouspathogenicbacteriumformostmarineanimals，anditcausesgreatlossesinaquacultureindustry．Todevelopaquantitativedetectionmethodofsplen—didusisimportantbecauseitspathogenicityiscloselyrelatedtothepop

5、ulationdensity．TodeveloparapidSYBRGreenIreal—timefluorescencequantitativePCRmethod，apairofspecificprimersweredesignedaccordingtosplendidusgyrBgenetodeterminethespecificityandsensitivity．Thereal—timePCRamplificationconditionswereoptimized．RecombinantplasmidcontaininggyrBgeneofsplendiduswa

6、sconstructedandusedtoestablishthestandardcurve．Thedetectionlimitandreproduc—ibilitywerecalculated．A251bpfragmentwasamplifiedfromchromosomalDNA，butnopositivere—actionwasdetectedin9otherbacteriaspeciesusingconventionalPCR，whichindicatedthattheprim—erpairhasgoodintra—speciesspecificityandin

7、ter—speciescommonality．Thestandardcurvewas十二五863项目(2012AA10A412-4)、科研院所技术开发研究专项项目(2011EG34219)、国家科技支撑计划课题(2叭2BADl7BO3)、国家自然科学基金项目(30901120；31202016)和青岛市战略性新兴产业培育计划项目(134．1．65一hy)共同资助$通讯作者。E-mail：liaomj@ysfri．ac．cn，Tel：(0532)85817991收稿Et期：2013-05-04；接受日期：2013-07—30作者简介：于永翔