建立sybr green实时rt论文

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1、建立SYBRGreen实时RT论文温冬青，赵锦荣，孔亚林，郭慧芳，阎小君【关键词】聚合酶链反应SYBRGreenIbasedrealtimequantitativeRTPCRmethodfordetectingmRNAleveloftypeIcollageninrats【Abstract】AIM:ToestablishSYBRGreenIbasedrealtimequantitativeRTPCRmethodfordetectingtypeIcollagenmRNAinrats.METHODS:TypeIco

2、llagencDNAplifiedbyRTPCRmethodandclonedintopMD18Tvector.Therebinantplasmidplate.ThemRNAexpressionoftypeIcollageninratsequantitativeRTPCRmethodidedasexpected.ThekiicsgraphafterrealtimePCRdetectedevenonemolecule.Thestandardcurveindicatedthelinerrelationshipbe

3、tplateconcentration.ThecorrelationcoefficientofexternalstandardbetethodfordetectingtypeIcollagenmRNAinratsissensitiveandspecific.RealtimequantitativeRTPCRbasedonSYBRGreenIisanexcellentcandidateasastandarddetectionmethodforlargescaleapplication.【Keyerasechai

4、nreaction；typeIcollagen；mRNA【摘要】目的：基于双链嵌合荧光染料SYBRGreenI，建立一种快速、灵敏的检测大鼠I型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法.方法：提取大鼠肝脏总RNA，RTPCR扩增I型胶原基因部分片段，将其克隆入pMD18T载体用作参比品.基于SYBRGreenI双链嵌合染料建立检测大鼠I型胶原mRNA表达水平方法.其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析.freelRNA0引言近年来，肿瘤间质的来源及间质成分的变化［1］与肿瘤浸润转

5、移的关系［2］逐渐受到人们的重视；骨、牙齿及皮肤等发育［3］的各个时期中各种主要组成成分的表达量的变化也成为发育和疾病监控在基础研究方面的趋势.而这些领域的研究热点常集中在基质金属蛋白酶及其抑制剂的研究上，而对作为细胞外基质主要成分之一的I型胶原的表达变化却少有报道.实时荧光PCR技术是目前最准确、重现性最好和国际公认的核酸分子定量定性检测标准方法,被广泛用于转基因研究、基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域［4-7］.已出现的荧光定量PCR方法有多种，其中应用前景最广的方法是SYBRGreenI荧

6、光染料法［8］和TaqMan探针法［9］.本文基于SYBRGreenI荧光染料利用实时荧光PCR技术就建立检测大鼠I型胶原表达水平的方法进行探讨.1材料和方法1.1材料SD大鼠（6an公司)；凝胶成像系统(Kodak公司).1.2方法1.2.1抽提总RNA正常大鼠处死，取80mg肝脏组织，按Trizol操作说明书提取总RNA.20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定所提RNA的完整性.测定吸光度，确定RNA的含量和纯度.1.2.2目的cDNA的PCR扩增按反转录试剂说明书进行cDNA的合成.根据大鼠I型胶原mRNA序列［

7、10］，运用DNASTAR软件设计一对特异性引物，分别为：5′CTCAGGGGCGAAGGCAACAGT3′和5′ATGGGCAGGCGGGAGGTCT3′.扩增片段长度为125bp.反应参数为95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸20s，共35个循环.1.2.3参比模板质粒构建PCR扩增产物纯化后，克隆至pMD18T载体，由上海生物工程公司进行序列测定.1.2.4实时荧光PCR反应系统敏感性测试及线性标准曲线绘制提取参比模板质粒，定量后分级10倍稀释至5×105/L，分别取每一数量级稀释液2μL作为

8、PCR模板，即每50μL反应体系中含有模板拷贝数分别为100，101，102，103，104，105，106，107，108.除反应体系中引入2×SYBRGreenI荧光染料［11］及循环数改为50外，其他同上，同时设立以水和空载质粒为模板（即靶基因拷贝为0）的对照反应.1.2.5实时荧光PCR反应系统特异性评定基于SYBRGreenI荧光染料的实时PCR反应的特异性评定是通过分析PCR产物的熔链曲