H9亚型禽流感病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR法检测方法的建立-论文.pdf

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1、青岛农业大学学报(自然科学版)30(3)：195～199，2013JournalofQingdaoAgriculturalUniversity(NaturalScience)文章编号：1674—148X(2013)03—0195一O5H9亚型禽流感病毒SYBRGreenI荧光定量RT—PCR法检测方法的建立徐守振，尹燕博(青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109)摘要：RT—PCR扩增H9亚型禽流感病毒(AIV(H9))的HA基因保守片段，将其克隆到pMD18一T载体，经测序验证正确作为阳性质粒。以阳性质粒为标准品，建立SYBRGree

2、nI荧光定量RT—PCR的标准曲线。结果表明，该方法灵敏性可达74．3copies／~L，且特异性好、重复性佳。SYBRGreenI实时荧光定量RT—PCR方法为H9亚型禽流感的病原的快速诊断和病毒的定量分析提供重要手段。关键词：H9亚型禽流感病毒；HA基因；SYBRGreenI荧光定量PCR中图分类号：$852．65文献标识码：ADOI：10．3969／J．ISSN．1674—148X．2013．03．009EstablishmentofSYBRGreenIReal-timeRT—PCRDetectingH9AvianInfluenzaVi

3、rusXUShouzhen。YINYanbo(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China)Abstract：ConservativefragmentofHAgeneofAIV(H9)wasamplifiedbyRT—PCRandclonedintopMD18一Tvector．Aftersequencing，thepositiverecombinantplasmidwasacquiredandusedt

4、oestablishstandardcurveoftheSYBRGreenIreal—timeRT-PCR．Theresultsshowedthatthesensitivitywassogoodthat74．3copies／~Loftheviruscontentcouldbedetected．Furthermore，thismethodwashighlyspe—cificandreproducible．ItisconcludedthattheSYBRGreenIreal—timeRT—PCRisagoodtechnologyforpathog

5、enicdiagnosisandvirusquantificationofAIV(H9)．Keywords：H9N2avianinfluenzavirus；HAgene；SYBRGreenIReal—timeRT—PCR禽流感(avianinfluenza，AI)是由于正黏病毒科养禽生产造成的巨大影响和损失，如何快速准确地流感病毒属的A型流感病毒(AIV)引起的一种禽检测AIV(H9)已成为防控的关键。类或人类感染的传染病。根据AIV的血凝素(HA)禽流感AI(H9)与新城疫(ND)、鸡传染性支气和神经氨酸酶(NA)抗原差异，AIV可分为16

6、个管炎(IB)临床症状相似，给AI(H9)的诊断造成了HA亚型(H1～H16)和9个NA亚型(N1～极大困难。传统的病毒分离和血清学诊断方法费时N9)口]。H9亚型AIV(AIV(H9))于1966年在美费力，不利于AIV(H9)的快速诊断；而常规RT—国威斯康星在火鸡中首次发现，自1999年以来也出PCR方法由于实验室污染等原因存在一定的假阳现AIV(H9)多次感染人的报道。目前，AIV(H9)性，且不能对病毒进行定量分析_3]。近年发展起来在我国广泛存在，可引起雏鸡死亡，生产性能下降，的实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术以

7、其快常与其他病原(如大肠杆菌)混合感染，给养禽业造速简单、高度灵敏和强特异性等优点广泛应用到基成严重经济损失I2]。鉴于AIV(H9)对人类健康和因表达分析，并引用到AIV的定性和定量检收稿日期：2013—07—09基金项目：青岛市公共领域科技支撑计划(10-3-3—17一nsh)；山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队项目作者简介：徐守振(1977一)，男，山东沂水人，副教授，博士，主要从事禽病防治研究。青岛农业大学学报(自然科学版)测[4]，但Real—timePCR方法用于检测AIV(H9)10×Buffer3肚L，MgC123L，dN

8、TP(10mmol／L)临床样品的研究很少。本试验旨在建立快速检测临2．5FL，rTaq酶0．5FL，上下游引物各0．5FL，反转床病料中AIV(H9)的SYBRG