兔出血症病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、动物医学进展。2013，34(12)：69—73ProgressinVeterinaryMedicine兔出血症病毒实时荧光定量RT—PCR检测方法的建立肖跃强，谢金文，徐二丹。，沈志强，丁壮(1．吉林大学动物医学学院，吉林长春130062；2．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；3．泰山医学院，山东泰安271016)摘要：为建立一种敏感、特异、简便的兔出血症病毒(RHDV)检测方法，根据GenBank中公布的RHDV全基因组序列保守区域设计了2对引物，筛选了其中1对建立并优化了PCR条件，扩增产物为33

2、1bp，并基于此建立了SYBRGreenI荧光染料real—timeRT—PCR检测方法。通过敏感性、特异性、标准曲线建立等表明，该方法可检出10以上拷贝数的模板，只在RHDV有特异性扩增，标准曲线线性相关性好。实际应用结果显示，该方法对疑似RHDV病料检测的阳性率为74．8，而普通RT-PCR方法检测的阳性率为65．5。该方法的建立为开展该病的诊断、疫苗制备质控等提供了有效的技术保障。关键词：兔出血症病毒；实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应；建立中图分类号：$852．659．6；Q789文献标识码：A文章编号：100

3、7—5038(2013)12—0069—05兔病毒性出血症(Rabbithaemorrhagicdis—性不高，有些虽然敏感性高，但成本较高。基于ease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbithaemor—SYBRGreen工荧光染料的实时荧光定量PCR诊rhagicdiseasevirus，RHDV)引起的一种严重危害断方法相对普通PCR能够提高敏感性，而且比养兔业健康发展与野兔生态系统平衡的急性传染TaqMan探针荧光定量PCR降低了成本，因此具有病，其特征为发病快、病死率高。该病于1984年春良好的应用前景。

4、目前该方法已经成为疫病诊断和在我国江苏、无锡首先暴发口]，并迅速传播至国内各开展免疫学、病毒分子生物学、病毒致病机制、病原省市及韩国、朝鲜等周边国家，墨西哥等国家由于和与宿主细胞相互作用等领域研究的一种重要的工中国兔产品贸易也导致发生该病。之后，在欧洲，该具，并且该方法容易标准化。因此，本文建立了病首先在意大利暴发，然后前苏联、匈牙利、波兰、德RHDVreal—timePCR检测方法，并开展了临床应国、捷克、西班牙、法国、比利时等国也发生流行]。用，与常规PCR方法相比具有敏感性更高、检出率由于该病发病率高，病死率高

5、达40～100，给养更高等特点。兔业造成严重的损失。国内外兽医工作者在病原1材料与方法学、临床诊断、预防等方面都开展了广泛的研究工1．1材料作，取得了很大进展。目前，兔病毒性出血症的诊1．1．1病毒兔出血症病毒、兔轮状病毒和兔水泡断，世界动物卫生组织(OfficeInternationalDes性口炎病毒，山东省滨州畜牧兽医研究院保存并提Epizooties，OIE)推荐使用血凝(hemagglutination，供。HA)试验、电镜观察、RT—PCR(reversetranscrip—1．1．2主要试剂2×Powe

6、rTaqPCRMastertion-polymerasechainreaction)、Westernblot、免疫Mix、dNTPs、rTaqDNA聚合酶、限制性内切酶、染色、原位杂交、动物回归试验等方法进行实验室诊RNA酶抑制剂，TaKaRa公司产品；2×SYBR断，同样，血凝抑制(hemagglutinationinhibition，Greenreal—timePCRMasterMix，ToYoBo公司产HI)试验、琼脂扩散试验(agar—gelimmunodifusion，品；DNA纯化回收试剂盒、小量质粒提取

7、试剂盒、蛋AGP)]、对流免疫电泳[4]、SPA菌体免疫扫描电镜白酶K、Trizol试剂，上海生工生物工程技术服务有法、酶联免疫吸附试验(ELISA)l6]、免疫电镜捕获限公司产品；反转录酶M—MLV，北京百泰克生物技双装饰法]、TaqMan探针荧光定量检测方法等术有限公司产品。也用于实验室诊断。但是，这些方法中，有些需要繁1．1_3引物设计及合成根据GenBank中公布的兔琐的样品处理过程，耗时费力，有些简单实用但敏感出血症病毒全基因组进行分析，应用PrimerPremier收稿日期：2013—10-20基金项目：

8、中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金课题作者简介：肖跃强(1978一)，男，山东临清人，助理研究员，硕士，主要从事预防兽医学研究。*通讯作者肖跃强等：兔出血症病毒实时荧光定量RT—PCR检测方法的建立712．3Real—timePCR进行梯度稀释。由图5可知，稀释所得的样品在拷采用优化的反应条件及程序进行real