柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

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1、园艺学报,2016,43(8):1613–1620.ActaHorticulturaeSinicadoi:10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0150;http://www.ahs.ac.cn1613柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用1121111,*王艳娇,崔甜甜,黄爱军,陈洪明,李中安,周常勇,宋震12(西南大学/中国农业科学院柑桔研究所,重庆400712;赣南师范大学国家脐橙工程研究中心,江西赣州341000)摘要:为了快速、灵敏地检测柑橘脉突病毒(Citrusveinenationvirus,CVEV),通过设计特异性引

2、物(EVqF4/EVqR4),优化反应条件,建立了CVEV的实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率101.8%;检测组内和组间变异系数均小于2.85%,重复性较好。利用所建立的实时荧光定量方法对柑橘植株进行检测发现,‘代代酸橙’和‘象山红’植株中CVEV分布不均匀,其中根部-1病毒滴度最高,分别为162.52和45.32拷贝·ngRNA,皮及叶部病毒滴度相对较低。关键词:柑橘脉突病毒;实时荧光定量RT-PCR中图分类号:S666文献标志码:A文章编号

3、:0513-353X(2016)08-1613-08DevelopmentandApplicationofaQuantitativeRT-PCRApproachforQuantificationofCitrusveinenationvirus11211WANGYan-jiao,CUITian-tian,HUANGAi-jun,CHENHong-ming,LIZhong-an,ZHOU11,*Chang-yong,andSONGZhen1(CitrusResearchInstituteofSouthwestUniversity,CitrusResearchInstituteof

4、ChineseAcademyofAgricultural2Sciences,Chongqing400712,China;NationalNavelOrangeEngineeringResearchCenterofGannanNormalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000,China)Abstract:InordertofastbydetectCitrusveinenationvirus(CVEV)withsensitivityandspecificity,aReverseTranscriptionQuantitativePolymeraseCha

5、inReaction(RT-qPCR)assaywasdevelopedwithselectiveprimerpairs(EVqF4/EVqR4)andoptimizedconditions.Usingthemethod,onlysampleinfectedwithCVEVshowedpositive,whilethosewithotherfivecitruspathogenswerenegative.Thesensitivityof2themethodwas100timeshigherthantheconventionalRT-PCR.Therewasagoodlinear

6、(R=0.992)relationshipbetweenthethresholdcycleandCVEVtemplateconcentration,whiletheamplificationefficiencyoftheRT-qPCRwas101.8%.Thecoefficientsofvariationoftheintra-andinter-assaywerebothwithin2.85%,indicatingagoodreproducibilityofthemethod.TheresultsalsoshowedthatCVEVwasunevendistributedins

7、ourorangeplantsandhybridcitrusplants,andtheamountofthevirusinroots-1wasthehighest(162.52and45.32copies·ngRNA,respectively),followedbythatinbarksandleaves.收稿日期:2016–06–06;修回日期:2016–08–17基金项目:农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(201203076);重庆市基础及前沿研究项目(CSTC2014jcyjA80033)

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1、园艺学报,2016,43(8):1613–1620.ActaHorticulturaeSinicadoi:10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0150;http://www.ahs.ac.cn1613柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用1121111,*王艳娇,崔甜甜,黄爱军,陈洪明,李中安,周常勇,宋震12(西南大学/中国农业科学院柑桔研究所,重庆400712;赣南师范大学国家脐橙工程研究中心,江西赣州341000)摘要:为了快速、灵敏地检测柑橘脉突病毒(Citrusveinenationvirus,CVEV),通过设计特异性引

2、物(EVqF4/EVqR4),优化反应条件,建立了CVEV的实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率101.8%;检测组内和组间变异系数均小于2.85%,重复性较好。利用所建立的实时荧光定量方法对柑橘植株进行检测发现,‘代代酸橙’和‘象山红’植株中CVEV分布不均匀,其中根部-1病毒滴度最高,分别为162.52和45.32拷贝·ngRNA,皮及叶部病毒滴度相对较低。关键词:柑橘脉突病毒;实时荧光定量RT-PCR中图分类号:S666文献标志码:A文章编号

3、:0513-353X(2016)08-1613-08DevelopmentandApplicationofaQuantitativeRT-PCRApproachforQuantificationofCitrusveinenationvirus11211WANGYan-jiao,CUITian-tian,HUANGAi-jun,CHENHong-ming,LIZhong-an,ZHOU11,*Chang-yong,andSONGZhen1(CitrusResearchInstituteofSouthwestUniversity,CitrusResearchInstituteof

4、ChineseAcademyofAgricultural2Sciences,Chongqing400712,China;NationalNavelOrangeEngineeringResearchCenterofGannanNormalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000,China)Abstract:InordertofastbydetectCitrusveinenationvirus(CVEV)withsensitivityandspecificity,aReverseTranscriptionQuantitativePolymeraseCha

5、inReaction(RT-qPCR)assaywasdevelopedwithselectiveprimerpairs(EVqF4/EVqR4)andoptimizedconditions.Usingthemethod,onlysampleinfectedwithCVEVshowedpositive,whilethosewithotherfivecitruspathogenswerenegative.Thesensitivityof2themethodwas100timeshigherthantheconventionalRT-PCR.Therewasagoodlinear

6、(R=0.992)relationshipbetweenthethresholdcycleandCVEVtemplateconcentration,whiletheamplificationefficiencyoftheRT-qPCRwas101.8%.Thecoefficientsofvariationoftheintra-andinter-assaywerebothwithin2.85%,indicatingagoodreproducibilityofthemethod.TheresultsalsoshowedthatCVEVwasunevendistributedins

7、ourorangeplantsandhybridcitrusplants,andtheamountofthevirusinroots-1wasthehighest(162.52and45.32copies·ngRNA,respectively),followedbythatinbarksandleaves.收稿日期:2016–06–06;修回日期:2016–08–17基金项目:农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(201203076);重庆市基础及前沿研究项目(CSTC2014jcyjA80033)

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