非洲马瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、动物医学进展。2013，34(12)：1卜16ProgressinVeterinaryMedicine非洲马瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立赵文华，杨仕标，李富祥(云南省畜牧兽医科学院国家外来动物疫病诊断实验室云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明650224)摘要：非洲马瘟病毒(AHsV)为双股RNA病毒，能感染所有马科动物。为建立一种AHSV快速检测方法，根据GenBank及作者所测AHSV9个血清型VP7一ORF全长核苷酸序列，设计一对位于AHSV基因组S7片段的特异引物

2、，然后进行荧光定量检测。经试验，证实该对引物对9种血清型的AHSVRNA均有特异性扩增，能检出特异荧光信号，而对与AHsV同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血症病毒(EHDV)及正常马淋巴组织和阴性对照均无扩增，无有效荧光信号可检出。以国家外来动物疫病诊断实验室已构建好的AHSV9型pMD18-T—VP7质粒为标准品可建立良好的标准曲线，实现对检测样本的实时定量。本研究建立了模板预变性结合“三步”法敏感特异的AHsV实时荧光定量RT-PCR快速检测方法，检测灵敏度可达10拷贝／vL。关键词：非

3、洲马瘟病毒；血清型；SYBRGreenI；实时荧光定量RT-PCR中图分类号：$852．651；Q786文献标识码：A文章编号：1007—5038(2013)12—0011-06非洲马瘟(Africanhorsesickness，AHS)是由VP7蛋白基因S7区段设计一对特异性引物，用实时呼肠病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的荧光定量RT-PCR方法对AHSV的快速定性和定非洲马瘟病毒(AHsV)引起的感染所有马科动物的量检测。一种非接触性病毒性传染病。本病以呼吸系统

4、和循1材料与方法环系统的病理变化为特征，目前发现至少有2种库1．1材料蠓属昆虫可传播该病，至少存在9个血清型。AHS1．1．1血清及病毒AHSV9个血清型的灭活冻在非洲的撒哈拉地区呈地方性流行，也曾在非洲北干疫苗均由Onderstepoort(SouthAfrica)引进，详部、中东、欧洲发生，该病的发生呈季节性。易感动细情况如表1所示。蓝舌病病毒(Bluetonguevi—物感染后的病死率最高可达95，一旦暴发会给养rUS，BTV)为本实验室保存，鹿流行性出血症病毒马业造成巨大的经济损失，因此世

5、界动物卫生组织(Epizootichemorrhagicdiseasevirusofdeer，(OIE)将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列EHDV)RNA为云南省出入境检验检疫局提供，冻为一类动物疫病]。存的正常马淋巴组织为哈尔滨畜牧兽医科学研究所鉴于该病的严重性和对养马业的毁灭性打击，馈赠。在国家及国际间流动的马匹必须要进行严格的动物1．1．2试剂、耗材及仪器TaKaRaMiniBestViral检疫，尤其是在地方流行区及无该疫病区域之间流RNA／DNAExtractionkit用于病毒RN

6、A的抽提，动的马匹更应该进行该病的检疫。国际赛马活动的OnestepSYBRPrimescriptRT—PCRkit用于普及以及马胚质资源的流动，边境地区非法走私马SYBR荧光定量RT-PCR，Goldview核酸染色剂均匹活动的存在，全球气候变暖引发生态系统改变进为宝生物工程(大连)有限公司产品；荧光定量PCR而使病原微生物生态变化等，种种因素皆可能造成反应管及ABI7500Fast荧光定量PCR仪为ABIAHS在非地方流行区域的暴发流行]。我国目前公司产品；BlowestAgarose为上海生

7、工生物工程虽为AHS无疫区，但随时面临该外来病被引入的风技术服务有限公司产品；氯仿、异丙醇、无水乙醇等险，因此有必要对该类外来动物疫病进行相应检测、其他试剂均为分析纯试剂。监测技术的贮备。本研究在已建立AHSV群、型特异RT-PCR检测方法的基础上[4]，选择保守的收稿日期：2013—03—26基金项目：公益性行业(农业)科研专项(200903037)作者简介：赵文华(1974一)，女，山东高唐人，副研究员，主要从事动物分子病毒学研究。*通讯作者12动物医学进展2013年第34卷第12期(总第24

8、6期)1．2方法溶解，引物贮存浓度为100pmol／t~L，工作浓度为1．2．1引物根据GenBank及作者所测序列，设20．0pmol／t~L。计特异性引物对。引物情况如下表2所示，引物由1．2．2病毒基因组RNA提取按照RNA提取试宝生物工程(大连)有限公司合成，为HPLC级别。剂盒说明书操作，简述如下：先用灭菌水按要求溶将合成的引物干粉用无RNase酶的PCR级水进行解非洲马瘟灭活疫苗冻干粉，然后取20O肚L待用。表2SYBRGreenI荧光定量RT—PCR引物Table2T