非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

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1、万方数据第28卷第1期V01．28No．1宁夏大学学报(自然科学版)JournalofNingxiaUniversity(NaturalScienceEdition)2007年3月Mar．2007文章编号：0253—2328(2007)01—0056—04非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立李维彬1’2，蒋正军¨，王玉炯孙，龚振华1，许崇波2，郭福生1，郑增忍1(1．农业部动物检疫所，山东青岛266032；2．宁夏大学生命科学学院，宁夏银川750021)摘要：为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒(MricanSwineFeverVirus，ASFV)定量检测

2、方法，根据TaqMan探针荧光定量分析原理，对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助，对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选，利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的M酽+、引物、探针浓度等参数进行了优化，其最佳浓度分别为4．5mmol／L，400nmol／I，和500nmol／L．同时，对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估，最低检出量为102个拷贝数的质粒，特异性为100％，CT(CycleThreshold)值的变异系数CV小于5％．对送检的15份(是否感染ASFV不确定)猪肉样品进行检测，结果全为阴性．试验表明，所建立

3、的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析，从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．关键词：非洲猪瘟；TagMan探针；实时荧光定量PCR分类号：(中图)S854．57；s852．695．5文献标志码：A非洲猪瘟(AfricanSwineFever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus，ASFV)引起的一种猪的烈性、高度接触性传染病[1]．ASF自1921年在肯尼亚首次报道以来，截至目前，该病流行于撒丁岛及邻近撒哈拉沙漠的部分非洲国家，在葡萄牙、西班牙、意大利及美国南部等地也屡有发生[2]．由于亚急性、慢

4、性ASF的存在，且该病与其他发热性猪病的临床症状和病理损伤有很大的相似性，因此对该病的诊断有一定的困难．目前，针对ASFV的检测和诊断技术主要有2大类，即基于病毒抗原、抗体反应的免疫学方法和针对病毒DNA的核酸检测技术．用免疫学方法检测抗体可以了解病毒感染以及疾病发生、发展的进程，然而，由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，因此，抗体检测在作为快速控制ASFV暴发的方法时存在局限性．PCR可以检测出各种样本(血液、粪便、分泌物、组织切片)中ASFV的遗传物质DNA，从而实现早期诊断，在ASFV的诊断和检测中具有重要的作用．近几年发展起来的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法将P

5、CR与荧光检测结合起来，克服了传统PCR费时、易污染，扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可对样品中的核酸进行准确的定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为病原体检测的重要方法．本文根据TaqMan探针荧光定量分析原理，对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析，建立了一种快速、准确、特异的ASFV定量检测方法．1材料与方法1．1材料与试剂DNAEngineOpticonTM全自动荧光定量PCR仪(MJReasearch公司)，HitachiU一2000紫外分光光度计．TaqPolymerase，质粒纯化试剂盒SKⅢI均购自上海生工生物

6、工程有限公司．1．2实时荧光定量PCR分析系统的建立1．2．1参比模板的构建以实验室构建的pET-ASFVP72作为参比模板(含ASFVP72全基因)．1．2．2引物和探针的设计用DNAStar分析软收稿日期：2005—04—15作者简介：李维彬(1981一)，男，硕士研究生，主要从事微生物基因工程研究．*通讯联系人：蒋正军(1964一)，男，副研究员，博士，主要从事病原微生物学与免疫学研究，(电子信箱)jiangzhengjun@epizoo．org王玉炯(1963-)，男，教授，博士，主要从事微生物基因工程研究，(电子信箱)wyi@nxu．edu．cn．万方数据万方数据58宁夏大学

7、学报(自然科学版)第28卷表1引物和探针浓度配比的CT值对10z～108个拷贝范围内的模板进行准确定量．2．1．2MgCl2浓度的确定Mg+浓度是影响PCR反应的关键因素之一，本研究用2．0，2．5，3．0，3．5，4．0，4．5，5．o，6．0mmol／L不同浓度的M92+对实时荧光定量P(、R检测效果的影响进行比较．结果表明，Mg+浓度对CT值有一定的影响，M矿+浓度为4．5mmol／L时CT值最小，检测效果最好，结果见表2．表2Mg*+浓