GBT 19438.4-2004 H9亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法

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1、ICS11.220一一B‘’汤日中华人民共和国国家标准GB/T19438.4-2004H9亚型禽流感病毒荧光RTP'CR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofavianinfluenzavirussubtypeH92004-02-14发布2004-02-15实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局．＊小-r-19I/N.91V1#19臂秘，花瞥撞臀豁荟发布1%11WGB/T19438.4-2004前．勺GB/T19438-2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分：—GB/T19438.

2、1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.2-2004((H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.3-2004((H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A是资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人：张利峰、张鹤晓、刘继红、郭晋优、刘艳华、杨伟。GB/T19438.4-2004H

3、9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本部分规定了荧光RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H9亚型禽流感病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语下列缩略语适用于本部分。3.1荧光RT-PCR荧光反转录一聚合

4、酶链反应。3.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的IA值时所经历的循环数。3.3RNA核糖核酸。3.4DEPC焦碳酸乙二醋。3.5PBS磷酸盐缓冲盐水。3.6Taq醉TaqDNA聚合酶。4原理H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法是采用TagMan技术。设计一对仅在H9亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，如5‘端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示）,3‘端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬

5、灭荧光基团（用Q表示）。当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发GB/T19438.4-2004出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核昔酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5'-3’外切核酸酶的功能，将探针切成单核昔酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合

6、成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。5材料与试剂5.1试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。5.1.1三氯甲烷。5.1.2异丙醇(-200C预冷）。5.1.3PBS;配方见GB/T19438.1--2004中附录A,1210C士2'C,15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL.5.1.475％乙醇：用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制，-200C预冷。5.1.5H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒‘’：组

7、成、说明及使用注意事项参见附录A,5.2仪器与器材5.2.1荧光RT-PCR检测仪。5.2.2高速台式冷冻离心机（最高转速12000r/min以上）。5.2.3台式离心机（最高转速2000r/min),5.2.4混匀器。5.2.5冰箱（(20C^-8℃和一20℃两种）。5.2.6可移动紫外灯。5.2.7微量可调移液器及配套带滤芯吸头（10uL,100pI_,1000p.L),5.2.8专用毛细玻璃管或PCR管。5.2.9Eppendorf管（1.5ml-)。6抽样6.1采样工具下列采样工具必须经121℃士2'C,15min高压灭菌并烘干：—一棉拭子；—剪刀、镊子；

8、一一注射器