GBT19438.3-2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT－PCR检测方法.pdf

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1、GB/T19438.3-2004月U舀GB/T19438-2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分:—GB/T19438.1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法));—GB/T19438.2-2004((H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》;—GB/T19438.3-2004((H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法);-GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A为资料性附录本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位:中华人民共和国北京出

2、人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人:高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹。.www.bzxzk.com.GB/T19438.3-2004H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件

3、，其最新版本适用于本部分。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语下列缩略语适用于本部分。荧光RT-PCR荧光反转录一聚合酶链式反应。32Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数3RNA核糖核酸。3.4Taq酶TaqDNA聚合酶。3.5PBS磷酸盐缓冲盐水。3.6DEPC焦碳酸乙二醋。4原理采用TagMan方法，通过比对禽流感病毒血凝素基因，设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5‘端标记FAM荧光素为报告荧光基团(R>

4、,3’端标记的TAMRA荧光素(Q)在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合t.www.bzxzk.com.GB/T19438.3-2004探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时，丁“，酶发挥5'-3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料5.1试荆除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均须使用

5、无RNA酶的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)进行分装。5.1.1H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，，:试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A.5.1.2三氯甲烷。5.1.3异丙醇。5.1.475%乙醇，用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。5.1.50.01mol/L(pH7.2)的PBS;配方见GB/T19438.1-2004中附录Ao121℃士2*C,15min高压灭菌后，无菌条件下按10000IU/ml一加人青霉素和链霉素52仪器设备5.2.1高速台式冷冻离心机:要求最大离心力在12000r/min以上5.2.2荧光PCR仪。5.2.3

6、计算机5.2.42℃一8℃冰箱。5.2.5一20℃冰箱5,2.6微量加样器:0.5pL--10p.L;5pL-20pI-;201,[r200pL;200fl,-l000yL,5.2.7混匀器。5.2.8可移动紫外灯:要求近工作台面。6样品的采集与前处理采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套6.，取样工具需要下列取样工具:-一棉拭子;—剪刀、镊子;—Eppendorf管;-一研钵。以七取样工具必须经121℃士2*C,15min高压灭菌并烘千。6.2采样方法6.2.1活禽样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法为:—对于咽喉拭子，采取时要深人

7、喉头及上领裂来回刮3次一5次取咽喉分泌液;—一取泄殖腔拭子时，将拭子深人泻殖腔转一圈沾取粪便;1)由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。.www.bzxzk.com.GB/T19438.3-2004—一将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放人盛有1.0mLPBS的Eppendorf管中备用6.2.2肌肉或脏器样品用无菌的剪刀、镊子取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，加lour工一PBS棍匀，1000g离心10min后，取上清液转人Eppendorf管中备用。6.2.3血清或血浆用

8、无菌注射器直接吸取至Ep