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《四步法消除SYBR Green Ⅰ实时定量RT2PCR中》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ISSN100727626中国生物化学与分子生物学报2004年6月CN1123870PQChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology20(3):387～392·技术与方法·四步法消除SYBRGreenⅠ实时定量RT2PCR中引物二聚体的影响1,2)1,2)1)1)3张驰宇, 张高红, 杨 敏, 贲昆龙(1)2)中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室,昆明 650223;中国科学院研究生院,北京 100039)摘要 为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时
2、定量RT2PCR方法,使之能够有效消除引物二聚体(PDs)对实时定量结果的影响.对RT2PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析.依据PDs和扩增产物的熔解温度(Tm)特点,在通用的三步法的延伸步骤之后,增加一个短暂的(5s)恒温和荧光检测步骤,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法.PDs的Tm通常高于72℃,但低于扩增产物的Tm.将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm时,四步法能够有效地消除PDs的影响.对三步法和四步法S
3、YBRgreenⅠ实时定量RT2PCR进行了比较,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量.选择Tm值尽可能小的引物,使PDs与扩增产物Tm值之间有足够的差距,将更有利于四步法的应用,并可成功地用于低丰度RNA的准确定量.关键词 引物二聚体,荧光实时定量RT2PCR,SYBRgreenⅠ,四步法,RNA定量中图分类号 Q291,Q786EliminationofPrimer2dimerEffectinSYBRGreenⅠReal2timeRT2PCRUsing
4、42stepProgram1),2)1,2)1),1)3ZHANGChi2yu,ZHANGGao2hong,YANGMinBENKun2long(1)LaboratoryforMolecularandCellImmunology,KunmingInstituteofZoology,TheChineseAcademyofSciences,Kunming650223,China;2)TheGraduateSchoolofChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China)Ab
5、stractTodevelopanewmethodforeffectivelyeliminatingtheeffectofprimer2dimers(PDs)inSYBRgreenⅠreal2timeRT2PCRthespecificampliconsandPDsformedbyRT2PCRweremeasuredbygelelectrophoresiswithethidiumbromidestaining,andthecharacteristicoftheirmeltingtemperatures(Tm)w
6、ereanalysedbymeltingcurves.Theso2called42stepprograminSYBRgreenⅠreal2timeRT2PCRwasdevelopedbyaddinga5sholdingattheoptimaltemperaturebetweenTmofPDsandampliconsforreadingfluorescencesignalafterextensionstepofRT2PCR,andwascomparedwith32stepprogramsonquantifica
7、tionoflowabundanceRNA.The42stepprogrameffectivelyeliminatedtheartifactofPDsinSYBRgreenⅠreal2timeRT2PCR.Inaddition,the42stepprogrammaybeusedforquantifyinglowabundanceRNA,whilethe32stepprogrammaynot.TheprimerpairwithlowTmshouldbepreferablyselectedfortheeffici
8、enteliminationoftheeffectofPDsonquantificationoflowabundanceRNA.收稿日期:2003206203,接受日期:2003208206国家自然科学基金项目(No.30170894)3通讯联系人:TelandFax:862087128321588,E2mail:kben@vip.sina.com现工作地址:昆明中海潮生物工程有限公司,昆明市科医路
