基于分子信标及核酸染料SYBR Green Ⅰ定量检测土壤中的汞.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2015年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1125—1129DOI：10．11895／]．issn．0253-3820．150122基于分子信标及核酸染料SYBRGreenI定量检测土壤中的汞翟琨向东山朱俊胡红青“(华中农业大学资源与环境学院，武汉430070)(湖北民族学院化学与环境q-程学院，恩施445000)摘要利用分子信标、单链核酸(ssDNA)及核酸染料SYBRGreenI，通过同步荧光分析法，建立

2、了一种高灵敏、高选择性土壤汞(Hg2)的定量检测方法。在该体系中，分子信标的荧光基团设计为荧光胺(FAM)，分子信标的环设计为与ssDNA互补，但有4个T碱基错配的序列。在Hg2存在时，分子信标的环与ssDNA通过“T-Hg2+-T”特异性结合形成双链DNA，分子信标的茎被打开，荧光基团与猝灭基团分开，荧光恢复；同时，核酸染料SYBRGreenI与双链DNA作用，SYBRGreenI的荧光信号显著增强。SYBRGreenI与FAM的最大激发波长与最大发射波长都很接近，通过同步荧光分析法检测时，两种荧光染料

3、的荧光峰重叠，荧光信号增强，可实现Hg的高灵敏检测。体系的最优检测条件为：缓冲溶液的pH=8．0，孵育温度为50~C，孵育4min，缓冲溶液中NaC1的浓度为30mmoL／L，SYBRGreenI工作液的体积为100gL。在优化条件下，Hg2浓度在5x10”～4．Oxl0mol／L时，SYBRGreenI及FAM总的荧光强度(AI，为体系在存在和不存在Hg时的荧光强度之差)与Hg2浓度(C)间有良好的线性关系，其拟合的回归方程为AI=1．3949C+19．3596(R=0．9976)，方法检出限(3o")

4、为3xlO。mol／L。本方法操作简单、快速、选择性好、灵敏度高、重复性好。关键词汞；分子信标；核酸染料SYBRGreenI；定量检测；土壤1引言汞(Hg)是有毒的重金属元素，在人体中具有累积效应和神经毒性，严重威胁着人类健康⋯。随着工业化、农业现代化及城市化进程的加快，大量的汞通过矿物开采、施肥及空气传播等方式进入农田，而土壤中的汞又通过“土壤一植物-人”的途径进人人体，对人类健康产生潜在的威胁。目前，定量检测汞的常用方法有原子发射光谱_3J、原子吸收分光光度法_4J、原子荧光J、色谱与光谱联用’及电感

5、耦合等离子体质谱法-8等。其中，很多方法需要较昂贵的仪器设备，不适合常规检测。核酸染料SYBRGreenI是一种不对称的菁类核酸染料，它本身的荧光信号很弱，与单链DNA几乎不发生作用，但它与双链DNA有很强的亲和性，且与双链DNA结合后，其荧光强度会显著增加。据报道，当核酸染料SYBRGreenI与双链DNA结合后荧光强度会增加800倍以上，是目前所发现的最灵敏的核酸染料之一L9J。基于特异性的“T—Hg一T”结构对汞的检测方法已多有报道。OnoLl叫及WangLl等分别基于“T．Hg2~-T”的特异性结

6、构建立了高灵敏、高特异性的检测水中汞的方法。此后，各种基于“T—Hg．T”结构对汞的定量检测，进一步提高了这类方法的灵敏度、选择性及设备的便携性等。尽管基于“T—Hg一T”结构对汞的定量检测方法较多，但方法的灵敏度并不令人满意。本实验利用T碱基与Hg能特异性结合形成稳定“T—Hg一T”结构的特点，将分子信标的环设计成与单链DNA互补且T碱基错配的序列，荧光基团设计为荧光胺(FAM)当分子信标在H存在时，与富含T碱基的单链DNA通过“T—Hg-T”结构形成双链，再与核酸染料SYBRGreenI作用，使体系的

7、荧光显著增强。据此建立了一种高灵敏的Hg荧光定量检测方法，并将其应用于土壤样品的分析中。2实验部分2．1仪器与试剂RF-5301PC型荧光光谱仪、PB-21型pH计(日本Shimadzu公司)；EthosPlus型微波消解系统2015-02-06收稿；2015-05-22接受本文系”863”课题(No．2012AA101402)、国家自然科学基金地区科学基金项目(No．21465010)及国家科技支撑计划(No．2015BAI305B02)资助·E·mail：Hqhu@mail．hzau．edu．cn．分

8、析化学第43卷(意大利Milestone公司)。SYBRGreenI(上海瑞安生物技术有限公司)，用无水二甲基亚砜制备10000倍浓缩液，超纯水稀释10000倍而得到工作液；Hg(NO)及其它化学试剂均为分析纯，购自美国Sigma公司和国药集团化学试剂有限公司。单链核酸均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：分子信标(MB)：5．BHQ．1．(CH，)．CCCGGGACGTGCGCGCTCGGCGTCGCGGTGC