基于荧光标记核酸探针及核酸染料SYBR GreenⅠ定量检测单链DNA.pdf

《基于荧光标记核酸探针及核酸染料SYBR GreenⅠ定量检测单链DNA.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第3期2013年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry325～329DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．2O603基于荧光标记核酸探针及核酸染料SYBRGreenI定量检测单链DNA郑爱华朱庆向东山何治柯(湖北医药学院公共管理学院，十堰444200)(武汉大学化学与分子科学学院，生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉430072)摘要建立了同步双色荧光定量检测单链DNA的方法。利用氧化石墨烯将荧光标记核酸探针的荧光猝灭，而

2、当其与待测液中的目标DNA发生杂交反应，生成的双链DNA脱离氧化石墨烯而使得染料荧光得以恢复，同时生成的双链DNA与核酸染料SYBRGreenI结合，使荧光增强。在优化条件下，目标DNA浓度在1xl0。～2x10mol／L范围内时，两种荧光染料的荧光强度之和与目标DNA的浓度之间具有良好的线性关系，拟合的回归方程为y=63．388x+9．3862，R=O．9954，检出限为85pmol／L。本方法灵敏度高、准确性及选择性好。关键词氧化石墨烯；SYBRGreenI；同步双色荧光谱；单链DNA；定量检测1引言DNA的检测方法很多

3、，常见的方法有光谱分析、电化学分析及生物学分析等[1娟】。在光谱分析中，荧光法具有操作简单、检测快速、灵敏度高和选择好等优点】，是定量检测DNA应用最广泛的方法之一。氧化石墨烯(GO)是一种单层的、二维的碳纳米材料。它具有很多独特的优点，如优良的电子、机械、导热和力学性能，以及在室温下具有较高的电子迁移率，因而备受关注和重视。GO能吸附单链DNA和芳香族化合物，对标记在单链核酸上的荧光染料的荧光具有很强的猝灭作用。当目标DNA存在时，目标DNA与荧光染料标记的DNA杂交形成双链，与氧化石墨烯的作用力减弱，使得探针上标记的荧光

4、染料远离氧化石墨烯表面，染料的荧光恢复。同时，生成的双链DNA与核酸染料SYBRGreenI结合，使荧光增强。SYBRGreenI是一种不对称的菁类嵌人性染料，它在水溶液中的荧光信号很弱，与单链DNA几乎不发生作用，但它与双链DNA具有很强的亲和性，作用后其荧光强度会显著增加。Xiang等利用经典分子信标和SYBRGreenI实现了对单链DNA的双色定量检测。由于经典分子信标在实际定量分析中存在两个问题。一方面，经典分子信标较强的背景信号会严重影响检测的灵敏度；另一方面，当分子信标引人到复杂基质中时，由于非特异性吸附会使分子

5、信标产生假阳性信号，影响定量检测的准确性。为解决这些问题，本实验以氧化石墨烯(co)为猝灭剂，并引入核酸嵌人染料SYBRGreenI。对于荧光标记染料ROX和核酸染料SYBRGreenI而言，它们的最大激发波长与最大发射波长的波长较接近，因此这两种染料的荧光信号可以通过同步扫描荧光光谱法同时获得，可对目标DNA实现双色荧光检测。由于SYBRGreenI荧光信号的增强仅由SYBRGreenI与双链DNA结合引起，而不受假阳性信号的影响，故利用SYBRGreenI的荧光信号对目标DNA进行定量检测，能避免假阳性信号的产生，从而显

6、著提高检测的准确度。此外，利用双色荧光对核酸的定量检测，其灵敏度、准确性和选择性均有所提高。2实验部分2．1仪器与试剂所有的荧光光谱及荧光强度的数据均由RF一5301PC型荧光光谱仪(日本Shimadzu公司)获得，同2012-06一ll收稿；2012一l1-30接受本文系国家自然科学基金(No．21075093)资助项目E—mail：zhkhe@whu．edu．cn326分析化学第41卷步扫描的荧光光谱中，激发波长与发射波长之间的波长间隔设置为20nm，激发和发射狭缝宽度均为10nm。PB一10酸度计(德国Sartoriu

7、s公司)；微量离心机(美国ThermoScientific公司)。SYBRGreenI(上海瑞安生物技术有限公司)；Tris—HC1缓冲溶液：由Tris，NaC1和0．1mol／LHC1配制；氧化石墨烯(GO，中科炭纳米科技公司)；所有试剂均为分析纯；实验用水均为去离子水；所有的核酸均由工程(上海)有限公司合成，其序列如下：荧光标记核酸探针(以下简称M_B)：5一ROX一兀TCTGATTACTATTGCVATCTYTCCGTTACAACT1]rrAAA一3；目标DNA(以下简称T)：5一AGTTGTAACGGAAGATGCA

8、ATAGTAATCAG-3；1个碱基错配DNA(以下简称MT)：5一AGTTGTAACGGAAGTTGCAGTAATCAG一3；2个碱基错配DNA(以下简称MT)：5．AGTTGTAACCGAAGATGCAAAAGTA_CAG-3；3个碱基错配DNA(以下简称MT)：5一AGTTGTATC