基于核酸适配体的非标记荧光检测方法研究

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityDissertationforMasterDegreeAptamer-BasedLabel-freeFluorescentAssayLvZhenzhenDirectedbyProf．LiChengandDr．ChenailiangAgriculturalProductProcessingandStorageEngineeringYa’anSichuanJul3e2014万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外

2、，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研箍签名：昌诊诊山烨年易月歹日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意l丛IJJl农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。烀本论文不保密。口本论文保密，在一年解密

3、后适用本授权。(请在以上口内划“√”)研究生签名：舀珍殄导师签名：穆魂印f牛年占月7日沙形形月夕日万方数据四川农业大学硕士学位论文摘要核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的一段具有识别作用的单链寡核苷酸片段，可为ssDNA和RNA。核酸适配体能够通过折叠形成特定的二级和三级结构与靶标高亲和力(pmol／L．pmol／L)高特异性结合。利用适配体技术开发的检测方法包括比色法、荧光法、电化学法等多种方法。其中荧光法具有简单、快速、易于自动化的特点，其有效性己被广泛证实。目前已经利用适配体开发了众多的荧光检测方法，但是大部分的荧光法需要对适配体进行修饰，

4、这些操作费时并且分析成本较高，甚至有可能因为适配体上修饰了荧光基团或者淬灭基团而影响适配体与靶标结合的特性，从而降低检测的灵敏度。因此，本研究利用适配体和荧光染料开发了快速、灵敏、简单的非标记型荧光法，能够应用于食品中毒素的检测，对于保障食品安全有着重大的意义，主要内容包括以下三部分。(1)利用荧光染料PicoGreen能够嵌入适配体与互补序列形成的dsDNA，从而引起荧光强度改变的特性开发了一种简单的通用型非标记荧光法，可高灵敏度高特异性的检测无机离子、蛋白质及小分子。通过优化PicoGreen染料的用量和检测时间，该方法对钾离子检测的检测限达到1pmol／L，线性范围为

5、1pmol／L．1mol／L；在10mmol／L、100mmol／L、200mmol／L的钠离子存在的条件下，lIxmol／L．1mol／L线性范围仍然能够实现对钾离子的检测：该方法与原子吸收光谱法分别对尿样中钾离子含量进行检测，用荧光法测得的钾离子的浓度平均是原子吸收光谱法测得的钾离子浓度的87士6％。对凝血酶检测限为10U、线性范围10．1000U；将1mg／mL的牛血清白蛋白分别添加到不同浓度的凝血酶溶液中进行试验，凝血酶浓度与F／Fo之间仍然具有非常好的相关性(r：．0．9805)。对腺苷检测限达到0．5rtmol／L，线性范围0．5gmol／L．5mmol／L；在

6、稀释20倍的胎牛血清样品中检测腺苷，检测限为0．5I_tmol／L，线性范围0．5pmol／L一5mmol／L。(2)利用构建的基于适配体和PicoGreen染料的非标记荧光法对赭曲霉毒素A(OTA)进行检测，在优化好的条件下，OTA检测限达到1ng／mL，线性范围1ng／mL一100pg／mL，特异性检测中，分别用非特异性靶标玉米赤霉烯酮、N．乙酰基．L．苯丙氨酸以及无关适配体(氯霉素适配体)进行试验，结果显示荧光强度并无明显变化，证明该方法对于OTA的检测具有非常高的特异性；并且将检测方法应用于缓冲液稀释为．1‘％的啤酒当中，能够检测到低至1ng／mL的OTA，线性范围

7、lng／mL。100t．tg／mL。万方数据四川农业大学硕士学位论文‘、(3)利用1，3，8，10．四氢-N，N，N，N’，N’，N’一六甲基．1，3，8，10一四氧代．蒽[2，1，9-def．'6，5，10．d⋯ef]-异喹啉．2，9，二丙胺二碘化物(PTCDI)染料建立了凝血酶非标记荧光法检测法。设置PTCDI染料的浓度分别为5nmol／L，50nmol／L，500nmol／L，1gmol／L，29mol／L，59mol／L，109mol／L进行优化，设置5gmol／L的适配体体积为5pL、10pL、15肚L、