核酸适体识别荧光法检测汞离子.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第12期2012年l2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1827～1831DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．20127核酸适体识别荧光法检测汞离子雷兆静l，张存政胡秋辉刘媛张强刘贤金(南京农业大学食品科技学院，南京210095)(江苏省农业科学院食品质量安全检测研究所，江苏省食品质量安全重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地，农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室，南京210014)摘要通过对已

2、知的Ni适体的改造，发现了对Hg2有较强结合活性的核酸适体N1，基于N1的二级结构进行改造，获得了具有较高活性的核酸适体N5，并建立了荧光检测方法。以荧光基团FAM标记核酸适体，在94℃变性5min，室温(25℃)下复性30rain后，适配体与标记有荧光猝灭基团DABCYL的～段互补序列Q2结合(适体与Q2的浓度比为1：3)，加入系列浓度的H与互补序列竞争结合核酸适体，以荧光信号的变化定量分析Hg浓度。结果表明，N1与Hg结合呈线性，线性范围为1．25~20rag／L；检出限为O．62mg／L；以Nl结构为基础

3、改造合成的序列和结构均不同的适体N4，N5，N6，N7对Hg的识别结合活性均不同，其中适体N5与Hg结合活性最为灵敏，特异性高，线性范围为0．156~2．50mg／L；检出限为78g／L。关键词核酸适体；荧光；汞离子；检测1引言重金属元素的定性与定量检测在环境监测、废弃物管理、发育生物学及临床毒理学等领域中具有很大的应用价值，而目前重金属元素的检测主要采用光谱法，包括原子吸收光谱】、原子发射光谱法闭、电感耦合等离子体质谱法嘲以及电化学法等方法。但这些方法依赖于大型仪器和专人操作，并且需要繁琐的样品预处理和浓缩过

4、程，在现场和野外检测中受到限制。因此研究无污染、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法进行微量金属离子的检测十分必要。近年来，随着分子生物学的发展以及核酸适体的筛选应用，特别是SELEX技术的应用，已经获得对金属离子(如ca2，Zn2+，Ni等)具有活性的核酸适体，以及基于核酸适体所建立的各种检测方法0】，包括荧光法、电化学法和比色法等。本研究利用已公开发表的金属离子适体进行改造应用，建立更加简便、快速、灵敏的检测方法。通过对Ni的RNA适体进行改造，期望获得两条原本针对Ni起作用的DNA适体，即DNA1一B(N1

5、)。但实验表明，N1对Nj不起作用，对Hg却有较强的结合作用嘲。核酸适体标记有荧光基团FAM，再与标记有荧光猝灭基团DABCYL的一段互补序列结合，通过加入Hg与互补序列竞争结合适体而引起的荧光信号变化，可定量分析Hg+[J。据此可设计出多种寡核苷酸的Hg检测方法，如荧光信号转换法”】、胶体金检测法[14】、荧光染料法”】；但均是采用核苷酸链中的胸腺嘧啶(T)可与汞配位的原理构筑器件，其核苷酸一级序列单一，二级结构简单甚至无二级结构。本研究表明，与Hg有作用的适体N1与此前所使用的多数适体结构不同；对Nl序列和

6、结构进行改造，得到与Hg作用更灵敏的新适体N5。本方法只需将样品简单处理直接加样反应即可，且样品用量少，适用于实际样品中Hg的检测。2实验部分2．1仪器与试剂多功能微孔板分析仪(BertholdLB940)；黑色96微孔板(Costar)。HgCI2标准溶液，缓冲液A：50mmol／LNaC1，7mmol／LMgCI2，50mmol／LTris／HC1，pH7．5。所用试剂均为分析纯，实用水为二次蒸201~03-15收稿；2O12_O6_18接受本文系江苏省农业科技自主创新项目(No．CX(10)236)、苏州

7、市科技支撑项目(No．SN201129)、中国博士后基金(No．20090451177)、江苏省博士后科研资助计划(No．0802023B)资助项目E-mail：jassliu@jaas．ac．cn分析化学第4O卷馏水。设计的DNA序列如表1所示，由上海捷瑞生物公司合成。表1合成的DNA序列Table1DNAsequenceusedinthisworkDNAM童：DNA卜BFAM-AUAGUCAGGGAACAUGACAAACACAGGGACUUGCGAAAAUCAGUGI兀兀兀GNl(Number1)FAMGG

8、ACAGGGACTTGCGGCAAATCAGTCCGN4FAM—GGACAGGGACTTTTTTTTTTTTAGTCCN5FAM-GGACAGGGACTTTCTTCTTGTTAGTCCN6FAM—GGACAGGGACTTTTTCCCCTTTTAGTCC，N7FAM—GGACAGGGACTTTTTGGGGTTTTAGTCC4GGAc，一Q1一BATGTTCCCTGACTAT—DABCYL