核酸适配体识别-荧光法检测赭曲霉素A.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第3期2011年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry3O0～3O4—一《研究报告2、!一核酸适配体识别一荧光法检测赭曲霉素A段诺吴世嘉王周平(江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，无锡214122)摘要建立了核酸适配体识别一荧光探针技术检测赭曲霉素A(OTA)的新方法。基于微孔板上固定的核酸适配子与目标物质OTA结合时构象发生变化，导致预先与其互补杂交的FAM标记短链DNA解离，引起荧光信号发生变化，据此可实现对OTA的定量检测。当微孔板包被亲

2、和素浓度为25mg／L、适配子浓度为50nmol／L，FAM标记互补短链DNA用量为150nmol／L，OTA结合缓冲液为10mmol／LHEPES(含120mmol／LNaCI、5mmol／LKCI、20rnmo~LMgC12、20mmol／LCaC12，pH7．O)，45℃反应40min时，可获得方法的最佳分析结果在最佳实验条件下，对OTA的检测线性范围为Z0×10～1．0×10一g／L；检出限为l×10g／L；相对标准偏差为2．6％(1×10～g／L，n一11)。本方法选择性良好，操作简单，已成功应用于实际样品中OTA的检测。关键词核

3、酸适配体；荧光；分子识别；赭曲霉素A1引言赭曲霉素(Ochratoxin，OT)是曲霉菌属和青霉菌属的某些菌种产生的空问代谢产物，基本结构为苯甲酸异香豆素，包含7种结构类似物。其中赭曲霉毒素A(oehratoxinA，OTA)在自然界分布最广泛，毒性最强【l】。OTA主要存在于谷类、豆类及豆制品、干果、咖啡、葡萄及葡萄酒、香科、油料作物、啤酒、茶叶等中。毒理学研究表明，OTA具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性[2~4l。1993年，国际癌症研究机构(TheInternationalAgencyforRes

4、earchonCancer，IARC)已将OTA列为人类可能致癌物。欧盟规定谷物原料中OTA最大限量5~g／kg，谷物加工制品中最大限量3pg／kg，婴幼儿及有特殊医疗目的食品中不超过0．5ktg／kg；我国规定饲料中OTA最大限量100g／1(g】。目前，检测OTA的方法主要有薄层层析法(TLC)、高压液相色谱一荧光检测法(HPLC—FD)、毛细管电泳技术(CE)、高压液相色谱一质谱联用(HPLC—MS)、酶联免疫吸附法(Enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、胶

5、体金免疫层析分析法(GICA)和放射免疫法(RIA)等[6。现场快速筛检以ELISA和GICA方法应用最多，这两种方法均是基于抗原一抗体亲和反应，以抗体为识别分子。但抗体易受外界条件尤其是温度的影响，对保藏条件要求苛刻，在很大程度上限制了方法的灵活应用。此外，抗体制备需要经过免疫动物实验或细胞实验，繁琐费时，成本高。核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexpo—nentialenrichment,SELEX)筛选而来的。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易

6、修饰、易固定、可反复使用和长期保存的优点，因此。以核酸适配体为识别分子构建的生物传感器在蛋白质研究、药物检测、医学诊断等方面得到了广泛应用”]。Cruz—Aguado和Penner口于2008年首先筛选得到了OTA核酸适配体并初步应用于OTA的检测，但由于检测时需要先对样品进行粗处理，后富集净化样品，然后再洗脱，最后用荧光检测器测定OTA自身荧光强度，涉及步骤多，相对复杂费时。本研究将核酸适配体识别技术与高灵敏荧光分析方法结合，建立了检测OTA的新方法。采用固定化的核酸适配体识别目标OTA分子，通过与核酸适配体互补杂交的荧光标记DNA短链的

7、解离引起的2010-07-18收稿；201f10-25接受本文系国家“863”it~(No．2008AA10Z419)、国家自然科学基金(N0．20805019)、教育部博士点基金新教师计划(No．20070295014)、江苏省自然科学基金(No．BK20081603)、“11l”引智计~lJ((No．B07029)资助项目E-mail：wangzp@jiangnan．edu．on；wangzp1974@hotmailcorn第3期段诺等：核酸适配体识别荧光法检测赭曲霉素A30l荧光信号变化来定量分析目标分子，涉及的适配体及FAM标记的适

8、配体互补链可预先在微孔板上组装好，测定时只需将样品简单处理直接加样反应即可。反应结束后略冲洗即可检测荧光信号，具有简单、灵敏、稳定等优点，已成功应用于实际样品中OTA的检测。2实