基于核酸外切酶iii的无标记荧光传感器的研究

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1、学校代码10530学号201510141463分类号O657.3密级硕士学位论文基于核酸外切酶III的无标记荧光传感器的研究学位申请人杨佩指导教师陈效兰副教授学院名称化学学院学科专业化学研究方向分析化学二〇一八年五月StudiesofLableFreeFluorescentBiosensorBasedonExonucleaseIIICandidatePeiYangSupervisorAssoc.Prof.XiaolanChenCollegeCollegeofChemistryProgramChemistrySpecializationAnalyticalChemis

2、tryDegreeMasterofScienceUniversityXiangtanUniversityDateMay，2018摘要摘要核酸外切酶是－类可以从核酸分子的一端逐一水解磷酸二酯键从而得到单个核苷酸的酶，它们对DNA序列没有要求，但有些核酸外切酶对DNA末端有一定的识别性，因而在用于设计生物荧光传感器的上有一定的灵活性。核酸外切酶III是核酸外切酶中的一种，其具有高效催化水解的能力，能特异性识别3’端平齐或凹陷的双链DNA，沿3’→5’方向逐步催化切除单核苷酸，从而到达提高传感器灵敏度。金属纳米簇（nanoclusters，简称NCs）是一种新型的发光纳米

3、材料，具有合成简单、高稳定性和良好的生物相容性，目前在许多领域里已经成为具有很大应用前景的新型荧光纳米材料，尤其是在生物荧光传感方面的应用。核酸适配体是一种利用体外筛选技术得到的寡核苷酸片段，是一段DNA（脱氧核糖核酸）或RNA（核糖核酸)序列），它可以高特异性、高选择性的结合目标物，因此被广泛的应用于生化分析、环境监测等诸多方面。核酸染料是用来构建荧光信号与目标物浓度之间的存在关系，利用其荧光信号强度的改变可以定量检测目标物。本论文主要利用核酸外切酶III的催化水解作用和金属纳米簇以及核酸染料的光谱特性并以此构建不同的生物传感器检测艾滋病病毒DNA、p53DNA、

4、赭曲霉毒素A（OTA），主要研究内容包括以下三个部分：(1)基于DNA链置换和核酸外切酶III无标记荧光法检测HIVDNA。当HIV不存在时，ExoIII将两个发夹DNA水解成单核苷酸和部分单链DNA结构，加入核酸染料SYBRGreenI（SGI）后，体系检测到一个微弱的荧光信号。当HIV存在时，HIV与发夹DNA1（HP1）、发夹DNA2（HP2）发生DNA链置换反应，释放出两端都是3’端突出的DNA长双链而不被ExoIII水解，加入SGI后，体系检测到一个强的荧光信号。实验结果表明，当HIV浓度在0.01-1nM范围内，体系荧光强度变化与HIV浓度呈线性，检出限

5、为2.14pM。实际样品（血清）的加标回收率为94.0%-98.0%。(2)基于金银纳米簇和核酸外切酶III无标记荧光法检测p53DNA。当p53存在时，在ExoIII的作用下释放出富含G碱基的DNA（G-DNA），G-DNA与已合成的DNA为模板的金银纳米簇部分杂交互补，使金银纳米簇的荧光信号强度由于富G序列的靠近而显著增强。当p53不存在时，加入ExoIII后不发生降解作用，缺少富G序列的靠近，金银纳米簇的荧光信号强度很弱。金银纳米簇的荧光信号的增强与p53的浓度的增强成正比，线性范围为0.5-15nM，检出限是51.1pM。实际样品（血清）的加标回收为98.2

6、0%-102.0%。(3)基于核酸适配体和核酸外切酶III无标记检测赭曲霉毒素A（OTA）。当OTA不存在时，DNA长双链（S1-S2）、发夹DNA1（HP1）、发夹DNA2（HP2）I摘要结构保持稳定，加入ExoIII后不发生水解作用，因而探针富含G碱基的DNA（G-DNA）未被释放出来，加入硫磺素T（ThT）后，无法折叠形成G四链体，检测到一个弱的信号。当OTA存在时，OTA与DNA长双链（S1-S2）中适配体链（S2）特异性结合，从而释放DNA长双链（S1-S2）中的S1以及S2的部分单链，使其分别与HP1、HP2杂交反应形成长双链DNA结构，加入ExoIII

7、后发生降解作用，释放游离G四链体序列，检测到一个强的信号。据此可以通过比色法、紫外法、荧光法检测OTA。其中荧光法的灵敏度最高，检测范围是3-150nM，检出限是323.5pM。在人体血清中用荧光法检测OTA的加标回收率为97.7%-107.4%。关键词：核酸外切酶III；金属纳米簇；核酸适配体；核酸染料；荧光传感器IIAbstractAbstractExonucleasesareenzymesthatcancatalyzethehydrolysisofphosphodiesterbondsfromoneendofanucleicacidmoleculetoob