基于滚环扩增和核酸外切酶ⅲ辅助循环放大的高灵敏荧光生物传感器研究

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1、３２学校代号：１０５１３１１１００２１学号：Ｓ密级：不保密湖南大学硕±学位论文基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大的高更敏焚光生物传感器研究：刘陈力为学位申巧人姓名导师姓名及职称：楚霞教授：化学化工学院培养单位：分析化学专业名称论文提交日期２０１６年５月：２０１６年５月论文答辩日期：俞汝勤教授答辩委员会主席湖南大学学位论文原创性声明立进行研究所取本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独引用的内容外，本论文不包含任何其得的研究成果。除了文中将别加标注他个人或集体己

2、经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个中明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果人和集体，均己在文由本人承担。作者签名；力巧曰期；年／月曰蘇备＾学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查入有关阅和借阅。本人授权湖南大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编、数据库进行检索，可Ｗ采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于。１、保密□，在年解密后适用本授权书２、不保密ｄ。＂＂（请在Ｗ上

3、相应方框内打Ｖ）作者签名；巧－力＾日期；年／月＾日导师签名：曰期：刀／＆年Ａ月曰＾ＩＳｔｕｄｉｅｓｏｆＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＢｉｏｓｅｎｓｏｒＢａｓｅｄｏｎＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅｌｉｃａｏｎａｎｄｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ－Ｒｅｃｃｌｉｎ乂ｍｐｆｉｔｉＥＡｉｄｅｄｙｇｂｙＬＩＵＣｈｅｎｌｉｗｅｉＢ．ａｎｓｈ．Ｓ（ＨｕｎＣｋｙＵｎｉｖｅｒ）２０１２ｙＡｔｈｅｓｉｓｓｕｂｍｉＵｅｄｉｎａｉｌｉａｌｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐ民ｅｑ山ｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒ

4、化ｅｄｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＳｃｉｅｎｃｅｎｉＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎｔｈｅＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆＨｕｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＰｒｏｆｅ巧ｏｒＣＨＵＸｉａＭａｙ，２０１６硕±学位论文摘要滚环扩増一（ＲＣＡ）作为种等温放大过程，有着极强的核酸扩増能力，不仅一可直接对特定的ＤＮＡ分子进行扩增，还能将飽核酸的信号进行放大，得到条由环形ＤＮＡ模板互补序列串联组成的长单链ＤＮＡ，。通过设计环形ＤＮＡ模板的序列可赋予ＲＣＡ产物药物负载、範标识

5、别、巧光成像等功能。核酸外切酶ＩＩＩ因其高效’的催化水解能力Ｗ及对３端平齐或凹陷的双链ＤＮＡ特异的识别能力被广泛应用到信号放大战略中。本研究论文将滚环扩增技术和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大技术一与生物传感方法相结合，构建了种多重信号放大的巧光生物传感平台，实现对核酸酶、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、小分子物质和离子的检测。（１）第二章，基于滚环扩增（民ＣＡ）和核酸外切酶ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）辅助循环放大一个稳健的传感平台用于Ｓ１核酸酶的高灵敏检测。将Ｓ１核酸酶的底，构建了物ＤＮＡ链（ｓＤＮＡ）设计成引发ＲＣＡ的引物ＤＮＡ链，得到的ＲＣＡ产物与大量’Ｔａ

6、ｑＭａｎ探针互补杂交形成ＴａｑＭａｎ探针３端凹陷的双链结构，在ＥｘｏＩＩＩ的存在’，。下，ＴａｑＭａｎ探针从３端开始被水解其上的炎光基团被释放产生巧光信号与此’Ｍ同时，３端凸出的ＲＣＡ产物则免遭酶切继续与其它Ｔａｑａｎ探针杂交，循环往复，产生显著增强的英光信号。当体系中存在Ｓ１核酸酶时，ｓＤＮＡ被水解成单个或小片段的脱氧核糖核巧酸，此时缺乏引物ＤＮＡ链，致使民ＣＡ反应和后续的Ｅｘｏｍ辅助循环放大反应无法进巧，从而检测不到英光信号，且英光强度随ＳＩ核酸酶浓度的增加而降低。由于进巧了双重信号放大，该方法展示了极其优异的灵敏性，７ｉ对３１核酸酶的检测下

7、限达到了５．０Ｘ１（ＴＵｉｌ／。该传感器用于实际样品分析中ｆ也有令人满意的结果。一（２）第Ｈ章，建立了种利用滚环扩増（ＲＣＡ）连接两次核酸外切酶ＩＩＩ（Ｅｘｏ－－ＩＩＩ）辅助循环放大（ＥｘｏｍＲＣＡＥｘｏＩＩＩ）的巧光传感平台用于超灵敏地检测ｍｉｃｒｏ’Ａ一ＲＮＡ。设计的３端凸出的发夹ＤＮ集识别禪标和信号转导多种功能于体，发夹ＤＮＡ和目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ互补杂交后形成双链部分的序列将被ＥｘｏＩＩＩ水解移除，从而释放出可继续打开其它发夹ＤＮＡ的目标ｍｉ