基于核酸滚环扩增的恒温基因分析技术

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1、基于核酸滚环扩增的恒温基因分析技术AMethodofGeneAnalysisBasedonRollingCircleAmplification工程领域：制药工程作者姓名：郜艳敏指导教师：齐浩教授企业导师：于祥春副高级工程师天津大学化工学院二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月

2、日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要基因缺陷与变异是遗传疾病以及众多难以治愈的慢性病之“源”，基因信息的获取已经成为精准医疗的基石。现代医学已经证明，在长期特定的生活环境下产生的特定基因变异，成为肿瘤癌症发生的主要原因。因此，基因信息的检测分析成为生物医学研究以

3、及临床诊断等的重要工具。本论文主要探索了针对癌症病理相关的基因变异，尤其是单碱基变异的分析检测技术，通过可设计的核酸探针，并结合恒温核酸滚环扩增（rollingcircleamplification，RCA）技术，初步实现了在室温环境下的高特异性、高灵敏度的单碱基基因变异分析。本论文以探索针对单碱基基因变异的高精度的分子检测技术为目的。为了实现可应用于大范围样品，并能够进行快速检测，本研究采用了全部反应可在室温范围内完成的环状探针（padlock）结合滚环扩增反应的技术。具体过程包括通过识别目标基因序列，快速形成具有特定序列的环状探针，通过滚环扩增反应迅速将环状探针信号放大进行检测。本

4、研究的分子探针设计中，成功地将热动力学平衡引入DNA分子的设计中，通过热力学分析计算，有效地实现了探针对于单碱基位点变异的基因序列的甄选能力，与传统的padlock方法相比，将特异性提高了近10倍。此外本实验还通过优化滚环扩增反应，进行微量信号的快速放大反应，通过优化扩增酶、反应温度等反应相关因素，验证了基于环状探针的滚环扩增可以实现可控的线性型及指数型信号扩增反应。并以肺癌发生的核心变异基因EGFR的T790M变异位点为模型，实现了高特异性的T790M变异基因的检测，初步验证了本技术的可行性。通过本论文的研究，开发了结合符合热力学平衡的探针设计与优化的信号扩大反应的单碱基变异基因检测

5、技术，实现了对于微量变异基因的高特异性检测。关键词：单核苷酸变异，锁式探针，热动力学，滚环扩增IABSTRACTGeneticdefectsandmutationsarethesourceofgeneticdiseasesandmanychronicdiseasesthataredifficulttocure.Sotheacquisitionofgeneticinformationhasbecomethecornerstoneofprecisionmedicine.Modernmedicinehasshownthatthespecificgeneticvariationthatoccu

6、rsinlong-termspecificlivingconditionsisthemaincauseofcancer.Therefore,thedetectionandanalysisofgeneticinformationhasbecomeanimportanttoolforbiomedicalresearchandclinicaldiagnosis.Inthisstudy,wemainlyexploredthetechniquesthataretheanalysisanddetectionmethodsofgenemutationrelatedtocancer,especiall

7、ysinglenucleotidevariation.Throughcombiningthedesignofnucleicacidprobewithrollingcircleamplification(RCA)technique,thehighspecificityandsensitivitydetectionofsinglenucleotidevariationwasrealizedatroomtemperature.Thepurposeof