环介导恒温扩增法快速检测艰难梭菌毒素基因

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1、分类号密级ＵＤＣ编号＾讀；省似／爹頭去学位论文环介导恒温扩増法快速检测艰难梭菌毒素基…因ＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴｏｘｉｎＧｅｎｅｉｎＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｉｃｉｌｅ－ｍｅ出ａｂｙＬｏｏｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｌｉ巧ｃａｔｉｏｎｐｐ林敏怡导师姓名陈拌教援专业名称内科学（消化系病）培养类型专业学位硕±论女提巧日期２０１５年３月２０日南方医科大学２０口级硕±学位论文环介导恒温扩增法快速检测艰难梭菌毒素基因ＲａｉｄＤｅｔｉｅｃｔｉｏｎｏｆＴｏｘｉｎ

2、Ｇｅ田ｅｉｎＣｌｏｓｔｒｉ姐ｕｍＤｉｆｆｉ州ｅｂｙｐＬｏｏ－ｍｅｄａ化ｄｏａ垃ｃａｔｉｏｎｉＩｓｔｈｅｒｍｌＡｍｌｉｐｐＮＣＥＴ－－课题来源：教育部新世纪优秀人才支持计划１０００９１）（广东省科技计划项目（２０１０Ｂ０３１２００００５）学位申请人林敏怡导师姓為陈焊教授专业違称内科学（消化系病）培养类型专业学位硕去培养层次硕去研究生所在学院第一恪床医学院答辩委员会主席曾志荣教授答辩委员会委员岳辉教授张北平教授杨定华教授白風教授陈焊教授２０１５年３月２０日硕壬学位论文环介导恒温扩增

3、法快速检测艰难梭菌毒素基因硕±研巧生嚇敏怡指导老师：陈焊教授摘要研巧背景’’艰难梭苗（Ｃ７ｏｓ化航ＷＪ（３？紙Ｃ沁，Ｃ．ｃ／紙ｃｉ／ｅ）是革兰氏阳性厌氧芽巧巧茵，本身无侵袭性。当机体肠道内环境受到破坏时，部分产毒性艰难梭菌通过分泌毒素Ａ、及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至伪膜性肠炎，统称为艰难梭苗感染（Ｃ．郝牌舱ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＣＤＩ）。据报道，随着艰难梭菌高毒力苗株（ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７型）的出现，艰难梭菌感染的发病率和死ｔ率均蟲著升高，引起全球的关注。艰难梭茵Ａ、Ｂ毒素。艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株，不

4、产毒株不引起临床症状艰难梭菌产毒株主要分泌毒素Ａ和毒素Ｂ，分別由ｔｃｄＡ和ｔｃｄＢ编码。毒素Ａ又称肠毒素，容易使肠壁中性粒细胞浸润，，释放淋巴因子引起机体液体大量分泌和出血性坏死，；毒素Ｂ又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。毒素Ｂ的毒力较毒素Ａ强１０倍。目前，已发现毒素Ａ阴性、毒素Ｂ阳性的菌株；而毒素Ａ阳性，毒素Ｂ阴性的菌株尚未被发现，表明毒素Ｂ可Ｗ单独致病。随着艰难梭菌感染的暴发性流行，艰难Ｉ中文摘要梭菌感染快速而敏感的实验室检测对于疾病感染的控制和临床诊治显得尤其重要。而选择ｔｃｄＡ和化ｄＢ

5、作为检测艰难梭菌的目的基因，能全面、特异的鉴定临床产毒株型艰难梭菌。‘＂Ｃ目前．ｉｃｉｌｅ，粪便中艰难梭菌检测阶金标准是细胞毒素中和试验（ｄｆｉｃｙｔｏｔｏｘｉｎｎ州杜ｄｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙＣＣＮＡ及艰难梭菌产毒培养Ｔｏｘｉｅｎｉｃ州Ｉｔｕｒｅ，，）（ｇＴＣ），但因培养条件苛刻、技术要求高、操作复杂及耗时，难Ｗ用于临床艰难梭茜的常规检测。利用酶联免疫试验巧ｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＩＡ）则特异、快，ＧｌｕｔａｉｍｔｅｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅＧＤＨ则敏感、快速不敏感，速；而孔胶凝集试驗（ｙｇ，）但该方法存在交叉反应、假阳性率高，

6、時异性差等缺点。国内外广泛应用的普通ＰＣＲ则因实验仪器要求高、操作繁琐，、耗时扩增完成后，仍需要通过对产物进行电泳、显影等步骤判读结果，不适合各地基层医院及现场快速检测使用。因此，寻找快速、特异、敏感的艰难梭菌检测方法是艰难梭茵感染研巧领域的新热点。艰难梭菌二元毒素在欧洲和北美洲引起广泛暴发流行的艰难梭菌高毒为菌株（ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７型）除分泌毒素Ａ和毒素Ｂ外，还分泌毒力更强的二元毒素（Ｃ．ｒｆ巧妃７ｅｂｉｎａｒｙ化ｘｉｎ，ＣＤＴ）。ＣＤＴ由致病性决定区夕ｈ的２个染色体基因ｃｄｔＡ和ｃｄｔＢ编码一。ｃｄｔＡ是种ＡＤＰ核糖转移酶，通过阻断肌

7、动蛋白片段的合成，诱导机体细一胞死亡。ｃｄ也是种运输蛋白，被丝氨酸蛋白酶激活后，ｃｄ旭通过与宿主细胞结合，把ＣｄｔＡ转移至细胞液中，诱导细胞骨架解聚，生成微管突出物，増强艰难梭菌的定植。因ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７型艰难梭菌的ｔｃｄＣ基因缺失１８个碱基，产生的毒素Ａ和毒素Ｂ分别是传统毒株的１６倍和２３倍，导致艰难梭菌感染病死率和耐药率均呈上升趋势。鉴于其暴发频率、危害性、国民的经济负担，迫切需要对艰难横菌二元毒素进行有效的诊断和控制。目前，