dna环介导恒温扩增法在快速鉴定病原微生物中应用

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1、维普资讯http://www.cqvip.com《生命的化学)2006年26卷5期462CHEMISTRYOFLIFE2006，26(5)OTechniquesandMethods文章编号：1000-1336(2006)05-0462-04DNA环介导的恒温扩增法在快速鉴定病原微生物中的应用王丽石磊李琳(华南理工大学轻工与食品学院，广州510640)摘要：DNA环介导的恒温扩增(LAMP)反应，是分子生物学领域中的一个新概念，它可以在恒温(60-65℃)条件下，3O～60min内将只有几个拷贝的靶核酸扩增到1o9水平。该方法的一大特色是，可以通过反应副

2、产物——白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在。因此，对于病原微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性等特点。LAMP方法在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有文献报道。表明，该方法已具有成功应用的现实性，为快速基因检测提供了一种新的技术途径；比PCR方法更具推广性，可望作为常规检测工具。关键词：DNA环介导的恒温扩增法(LAMP)；病原微生物中图分类号：Q78近30年来，全球流行病趋势表明，致病微生补的双链，从而挤掉FIP引起的DNA单链。与物越来越以微小多变甚至是分子的形式穿越人类此同时，BIP引物与被挤

3、掉的这条单链杂交结空间，难培养和不能培养的病原微生物已经成为合，形成的环状结构被打开，接着，B3引物在传染性和感染性疾病的主要根源【”。一些常规的BIP外测进行碱基配对，在聚合酶的作用下形成病原菌检测方法(例如，大量增殖菌数、菌落纯新的互补链。被置换的单链DNA两端均存在互化分离、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清补序列，从而发生自我碱基配对，形成类似哑铃学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之状的DNA结构。LAMP反应以此DNA结构为起处，已经愈来愈跟不上人类对致病微生物快速、始结构，进行再循环和延伸，靶DNA序列大量简易、高特异性的鉴定要求。因

4、此，在分子生物交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花学水平上来研究这些病原菌的核酸结构和分子特椰菜形状的茎一环结构的DNA，数量级可达10征，将对那些难以人工培养和不能人工培养的病(原理见图1【】)。原微生物进行正确地鉴定非常适用，以大大提高1．LAMP方法的特点对病原菌的检测和研究能力。目前，在病原菌的1．1扩增反应的进行和扩增产物方便、快捷鉴别分子生物学检测方法中，核酸扩增法是最有效的LAMP反应的副产物是白色焦磷酸镁沉淀[41，工具之一。肉眼即可观察，是鉴定反应是否进行的最直接的2000年，Notomi等[21开发出一种新的DNA环参照。另外

5、，LAMP扩增产物可以像PCR反应一介导的恒温扩增法(1oop—mediatedisothermalamp—样利用凝胶电泳并结合成像系统进行检测。成像lifieationofDNA，LAMP)。利用Bst大片段DNA结果显示，LAMP反应会产生许多不同大小的条聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引带，条带大小相差100bp左右，可以通过产生的物(FIP由F1C和F2组成；BIP由BIC和B2组不同梯型来区分特异性扩增和非特异性扩增。反成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的应产物还可以用限制性酶进行消化来鉴定产物的6个独立区域。FIP引物的

6、F2序列与靶DNA上互结构和大小。补序列配对，启动循环链置换反应。F3引物与模利用LAMP方法检测病原微生物，不仅可以板上的F3C区域互补，引起合成与模板DNA互对反应结果进行定性，而且还可以通过利用焦磷酸镁沉淀的产生量与DNA的生成量之间的线性关收稿日期：2oo6一O5—3O系，对反应的DNA进行定量。广东省科技厅农业攻关计划(No．2005A11601101)作者简介：王丽(198O一)，女，博士生，E-mail：blacktama-1．2LAMP反应特异性强、灵敏度高针对病原to@126．corn；李琳(1962一)，男，汉，教授，博士生导师，联

7、微生物特异性基因靶核酸序列设计的两对内外引系作者，E—mail：felinli@scut．edu．ca维普资讯http://www.cqvip.com●技术与方法《生命的化学)2006年26卷5期CHEMISTRYOFLIFE2006，26(5)B1C5’量I_．里量：星：，百-_i芎嗣—2E曼塑苎里：：兰：：：：：I!：里：!!竺l自环3’F零酏删6个独域【Bst大片段酶)。母。⋯⋯⋯再循环一}’F，Ip。rl肿榔上、延伸厂⋯厂～》譬一霜r——肿杂交在耻，—卺≥物，可以严格地识别靶核酸序列上的6个独立区(DNA)1+dNTP—+(DNA)+PzO74

8、-域，所以LAMP反应不会受到反应混合物中存在P2o74-+2Mg2~—}Mg2P207的非靶