海蜇幼体环介导等温扩增快速检测方法的建立和应用.pdf

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1、第36卷第4期2017年11月应用海洋学学报JournalofAppliedOceanOgraphyV01．36．No．4Nov．，2017海蜇幼体环介导等温扩增快速检测方法的建立和应用孙婷婷1’2，刘中援2，梁丽琨1，董志军2(1．烟台大学生命科学学院，山东烟台264005；2．中国科学院烟台海岸带研究所，山东烟台264003)摘要：针对海蜇早期生活史阶段幼体种类鉴定困难的问题，建立一种快速、灵敏、操作简便的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法．根据海蜇的线粒体细胞色素C氧化酶I基因(COI)编码序列，设计LAMP引物，建立了海蜇幼体LAMP快速检测方法，并对LAMP反

2、应体系、反应温度和反应时间进行了优化．结果表明，LAMP方法对海蜇目的基因的最小检测限为0．1ngDNA．该检测方法特异性较强，与黄渤海其他常见钵水母种类海月水母、白色霞水母、沙海蜇均无交叉反应．利用本研究建立的海蜇LAMP检测方法对不同海域采集的成体海蜇样品和海蜇螅状幼体进行检测，结果显示，成体海蜇和海蜇幼体均呈现阳性结果，表明海蜇LAMP检测方法可以对海蜇幼体进行快速有效的检测．海蜇LAMP检测方法简单快速、灵敏且特异性强，可使其运用于沿海渔业部门海蜇资源的调查工作．关键词：海洋生物学；海蜇；环介导等温扩增；快速检测；螅状幼体DOI：10．3969／J．ISSN．209

3、5-4972．2017．04．010中图分类号：P735文献标识码：A文章编号：2095-4972(2017)04-0538-07海蜇(Rhopilemaesculentum)，属刺胞动物门，钵水母纲，根口水母目，根口水母科，海蜇属(Rhopile—ma)．海蜇是我国沿海广泛分布的可食用大型水母，也是我国沿海渔业的重要捕捞对象。1J．根据《中国渔业统计年鉴》统计数据，2016年我国海蜇资源年产量约2．8×105t，海蜇产业产值近百亿元’2J．海蜇的生活史复杂，有明显的世代交替现象，包括有性浮游世代和无性底栖世代．成熟的海蜇营浮游生活，通过有性生殖产生受精卵，进而发育成浮浪幼

4、虫，浮浪幼虫附着在海底变态为早期的螅状幼体，螅状幼体可通过无性繁殖形成新的螅状幼体，在适宜的环境条件下，螅状幼体横裂成碟状幼体，碟状幼体再经发育变态为水母体一J．海蜇早期生活史阶段幼体的种群数量直接决定成体海蜇的渔业资源产量，因此，对海蜇早期生活史幼体阶段的种群动态调查对于海蜇资源的预测预报和评估具有重要意义．海蜇不同生活史阶段的形态差异较大，海蜇成体因其个体较大、分化程度较高，形态特征易分辨；而海蜇幼体阶段形态差异细微难以辨别，基于形态学特征的传统物种鉴定分析方法具有局限性，制约了对海蜇早期生活史阶段种群动态的研究，难以满足海蜇资源野外调查观测的需求。4引．如：董婧等(2

5、013)对白色霞水母(naenozakii)、海月水母(Aureliaaurita)、沙海蜇(Nemopilemanomurai)和海蜇的螅状幼体形态进行了比较观察，由于4种水母螅状幼体较小，需要在解剖镜和显微镜下通过螅状幼体的外部形态与触手表面的刺细胞丛的分布差异来进行区分。6o．另外，海蜇幼体在采集过程中易受损，增加其形态鉴定的难度．目前，国内外已经开始采用分子生物学方法对钵水母幼体进行种类鉴定，主要包括DNA条形码、实时荧光定量PCR和DNA芯片等，但因实验程序繁琐耗时，对仪器设备、实验成本要求较高等缺点限制了其在基层机构开展鉴定工作时的应用。7。11I．由Notom

6、i等(2000)研究发明的环介导恒温核酸扩增方法(100p．mediatedisothermalamplification，LAMP)即一种等温扩增技术‘12

7、．该技术通过针对靶基因6个区域设计的4条特殊引物和具有链置换活收稿日期：2017-03-09基金项目：国家自然科学基金资助项目(41576152)作者简介：孙婷婷(1992～)，女，硕士研究生；E—mail：suntingjy@163．com通讯作者：梁丽琨(1966～)，女，博士，副教授；E—mail：lian96903103@sina．corn；董志军(1981～)，男，博士，副研究员：E-mail：zjdong

8、@yic．ac．cn4期孙婷婷，等：海蜇幼体环介导等温扩增快速检测方法的建立和应用．539．性的DNA聚合酶，使得模板两端引物结合处循环出现环状结构，实现等温条件下引物与模板的链置换扩增反应．该方法具有操作简便、产物易检测、特异性强、灵敏度高、且不需电泳仪和PCR仪等仪器设备的优点，在贝类病原性寄生虫鉴定、对虾病毒鉴定、有害赤潮种类鉴定、有害水母种类鉴定方面已经得到成功的应用¨}16o．本研究针对海蜇的线粒体细胞色素c氧化酶I基因(COI)编码序列进行引物设计，建立了海蜇的环介导等温核酸扩增技术快速检测方法，并验证