羊痘病毒环介导等温扩增检测方法的建立

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1、西南大学硕士学位论文羊痘病毒环介导等温扩增检测方法的建立姓名：黄鹤申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：刘力；李应国20120601摘璎羊痘病毒环介导等温扩增检测方法的建立预防兽医硕士研究生黄鹤指导教师刘力副教授：李应国高级兽医师中文摘要羊痘病毒(Capripoxvims，CaPV)能引起山羊、绵羊和牛的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿，病畜产乳量急剧减少，皮毛品质极人下降，造成巨大经济损失。不同毒株的毒力有较大差异，易感动物的致死率可达10％～58％或75％～100％不等，同时，冈感染羊痘病毒造成山羊、绵羊和牛及制品的国际贸易受到限制，致使

2、此病成为重要的经济疾病。羊痘病毒属(op，伽wfms)由山羊痘病毒(GoatpoxvinIs，G11PV)、绵羊痘腐毒(SheeppoxvinIs，SPPV)和牛疙瘩皮肤病病毒(Lumpyskjndi∞a∞vj八Is，LsDV)组成，它们具有很强的宿主特异性，自然条件下，不会发生交叉感染。SPPv及GTPV呈世界性分布，现在广泛分布于非洲、中东、北欧、地中海各国等，我国近年来在如广西、贵州、黑龙江等地也有发生。1929年赞比亚首次发现牛疙瘩皮肤病(LumpyskiIldi靶a∞，LsD)，随后传入南非、坦桑尼亚、以色列及埃及，目前主要分布在非洲中

3、南部地区，并有向欧洲及亚洲扩散的趋势。传统的病毒学试验和血清学试验虽成本较低、操作简单，但存在耗费时间艮、特异性和灵敏度不高等缺陷。随着分子检测技术的发展。PCR及实时荧光PCR也有较广泛的应用，但由于需要实时荧光定量PCR仪等昂贵的仪器没备、操作程序复杂等缺点，不利于现场快速诊断检测。目前，我国尚无LSDV流行的报导，同时也无检测该病的相关研究，因此，建立一种快速灵敏的检测方法，对防止．牛疙瘩皮肤病传入和加强我国羊痘病毒的监测具有重要的现实意义。环介导等温扩增方法(LooPmedialedisothe加alamplification，LAMP)

4、是Notomi等(2000)发明的一种新型的等温核酸扩增技术。该技术利用设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的八个独立区域，利川BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，可以在1h之内，将靶DNA片段扩增109～1010倍。该方法具有简便快速、无需昂贵的扩增设备、高特异性及灵敏度、结果鉴定直观简便等特点，1卜常适合丁基层及现场检疫：I：作。现已，“‘泛应用r如禽流感病毒。沙I’j氏菌及恶性疟原虫等病毒、细菌及寄生虫性病原体的检测。本文通过分析GenBank中羊疸病毒的保守基冈序列，选取末端重复序列(InvenedteminalrcI)eat

5、，lTR)为靶基冈，运刚在线设计软件PrimerExplo他r4．O(hltp：／巾rime他xplore咄p／elamp4．0．0／jndex．html)，设计LAMP引物。利用LAMPReaITimeTurbidimeIerLA．320仪对反应进稗中的浊度进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、最两南人学硕十学侍论文大扩增速率、达到最人扩增速率所需时间及进入平台期所需时间等参数进行分析，筛选出对羊痘病毒核酸高效、特异扩增的圳P引物。针对影响洲P反应效率的重要参数进行优化，确定CaPV-IAMP检测方法的最优反应体系，弗经试验验证引物的特异性

6、和最低检测限。通过采用同一批次和不同批次提取的DNA验证CaPV-IAMP的可重复性，并对不同感染组织进行检测，对开发IAMP法羊痘病毒检测试剂盒进行了初步性探索研究。主要研究成果如下：1、根据上述优化试验，最佳的反虑体系为：60pmolFlP1芦L，60pmolBIP1声lL，5pmolF31∥L，5p脚【olB31．￡lL，8uBstDNAPolymerase1∥L，2×lkactionMix12．5∥L，模板DNA2pL，Calcein1∥L，ddH204．5∥L，总体积为25∥L。优化反应条件为：62℃恒温反应60曲；80℃，511lin

7、终止反应。2、灵敏度试验表明，本文建立的圳P法的灵敏度远远高于OIE推荐的普通PCR法，L蝴P最低可检测到lo．L51TClD∞，而PCR法最低检测限量为101一％rCID50。特异性试验朱发现非特异性扩增，说明其具有较好的特异性。3、在反应前添加经螯合处理的Calcein，肉服可直接观察结果。避免了琼脂糖凝胶电泳检测IAMP产物的复杂操作，同时极火减少了浑浊度判断时的误差。4、同一批次DNA和不同批次DNA分别进行Lf～MP检测，其变异系数(Cv％)分别为1．65％、8．66％，符合率为98．35％和91．33％，表明该方法具有较好的稳定。本文

8、建立的CaPv．乙蝴P检测方法可在1．5h内完成病毒核酸的提取和L蝴P检测全过程，该方法只需水浴锅即可进行检测，具有快速高效、操作简便、