猪支原体肺炎环介导等温扩增诊断方法的建立

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1、猪肺炎支原体环介导等温扩增诊断方法的建立李鹏J马艳娇薛晓萌S刘丛-夏伟I1、黑龙江八一农星大学动物科技学院,黑龙江大庆1633192、讷河市畜牧水产推广屮心,黑龙江讷河161300摘要：目的：建立临床诊断猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)的新方法。方法：根据GenBank上发表的猪肺炎支原体的核昔酸序列，针对该核昔酸序列设计4条特异性引物，其外引物扩增片段大小为276bp,通过对内外引物的比例、dNTP-浓度、Mg2+浓度和BstDNA聚合酶用量等条件逐一优化后，成功建立了猪支原体环介导等温扩增方法(LAMP)o结果：LAMP方法在恒温60C条件下lh特异

2、性较强，其敏感性为当其猪肺炎支原体的拷贝数低于为3〜6时，不能检测到该病原体。且试验中检测到多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌均呈阴性。讨论:环介导等温扩增方法诊断猪肺炎支原体具有很好的敏感性和特异性.关键词：猪帅炎支原体；环介导等温扩增；诊断DevelopmentofLoop-MediatedIsothermalAmplificationMethod(LAMP)forthedetectionofswineMycoplasmahyopneumoniaeAbstract:Object:ThenewmethodofMycoplasma

3、hyopneumoniacwassetupinourexperimenl・Method:Thetwopairsofthespecificprimesweredesigned,accordingtothenucleotidesequenceofMhwaspublishedbyGenBank・Thefragmentwasamplifiedbytheexternalprimers・TheLAMPmethodofswineMhwassuccessfullysetup,afteroptimizationoftheconcentrationoflheinternalandexternalprim

4、ers、dNTP"、Mg**andthevolumeofBstDNApolymerase・Result:TheresultwasthattheLAMPmethodwasmorespecificandsensitiveunderthe60°C、60min.YetthedetectionoftheamplificationwerenegativeforPastcure!lamu!toeida、Actinobaci11us>Streptococcuspneumoniae^Bordetellabronchi、Haemophi1usparasuisandStreptococcus.Discus

5、s:Sothemethodhadwe11Sensitivityandspecificity.Keyword:Mycoplasmahyopneumoni日e;LAMP;diagnosis猪气喘病乂称为猪支原体肺炎(Mycoplasmahyopneumoniae),它是由肺炎支原体引起的一种慢性接触性呼吸道传染病［1］。支原体可通过空气传染，很难隔离和阻断传播途径，且猪群的感染率很高，本病发病率高、且流行很快，并在逐年上升，在全世界流行十分广泛，焰危害养猪业最严重的疾病，给养猪业造成严重经济损失［2］。目前猪支原体体外分离培养和鉴定具有一定的困难，所以在发展中国家及我国临床条件收稿日期：

6、；修回日期：基金项目:大庆市科学技术局项目(SGG2007-048)通讯作者：李鹏(1971—),男，山东，副教授，博士，研究方向：生物化学与分子生物学。通信地址：黑龙江八-•农星大学动物科技学院李鹏(收)Tel:13836962800E-mail：lipeng98@163.com有限的地区建立一种简也、快速的诊断方法就尤为垂要，虽然现在该病有很多诊断方法，但是都需要较髙的实验室条件，因此在临床上建立一种简单、快速的诊断方法具有重要实践意义⑶。2000年，Notomi等捉出的一种新的核酸扩增技术——环介导等温扩增(LAMP),它是一种通过设计四条特异性引物來鉴定目的基因的方法，而且它

7、还是一•种快速、简便、准确和廉价的基］大I扩增法，在全世界很多发展中国家和临床条件有限的地方被广泛的应用，本研究主要建立猪肺炎支原体LAMP诊断方法［4-6］o1材料和方法1.1菌株及培养猪肺炎支原休、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌为本实验室保存。1.2主要试剂BstDNA聚合酶购自NEB生物技术有限公司；LAtaq酶、dNTPSDNAMarker2000、PMD18-T载体购自人连宝生物工程冇限公