环介导等温扩增技术检测嗜水气单胞菌方法建立

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1、插要摘要环介导等温扩增(100p-mexiiatedisothermalamplification，简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在lh内能扩增出109靶序列拷贝，扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏废高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。

2、本研究针对已报道的嗜水气单胞菌(aeromona$by．drophila，Ah)保守的气溶素基因(aerolysin,Aer)设计了3x于特异性的引物，利用环介导等温扩增(LAMP)技术来扩增Ah基因组DNA，扩增出一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，成功建立了LAMP检测Ah的新方法。该方法特异性好、敏感性高而且节省时间。本实验分别设计了LAMP和PCR的温度梯度和浓度梯度实验，从而获知LAMP检测Ah的最适温度是64℃，LAMP对抽提的AhDNA最低检出浓度为38fg／tube，PCR

3、对AhDNA最低检出浓度38pg／tube。LAMP对Ah的活菌浓度最低检出量为32cell／tube，两PCR却检测不到。LAMP技术的灵敏度是PCR的1000倍，并且比PCR方便快捷。本实验还通过设计一对环引物对整个体系进行优化，使检测时间缩短至半个小时，同时提高了反应的灵敏度。关键词：等温扩增；核酸；链置换反应；内引物；外引物；嗜水气单胞菌IIABSTRA(?rABSTRACTAnovelnucleicacidamplificationmethod,termedloop-mediatedisothermalamplific

4、ation(LAMP)，whichamplifiesDNA、vitllhi曲specificity,efficiency,andrapidityunderisothermalconditions，maybeavaluabletoolfortherapiddetectionofinfectiousdiseases．ThismethodemploysaDNApolymerasethathaveactivityofstranddisplacementDNAsynthesisandasetoffourspeciallydesignedp

5、rimersthatrecognizeatotalofsixdistinctsequencesonthetargetDNA．LAMPcallamplifyafewcopiesofDNAto10’inlessthananhour．Thefmalproductsarestem·loopDNAwithseveralinvcnedrepeatsofthetargetandcauliflower-likesnllcnlreswithmultipleloops，Apositivereactionwouldbeshownasaladder-l

6、ikepatterninngelelcetrophorcsisanalysis．Becauseoftheadvantage．theLAMPmethodwillbewidelyappliedtoresearchofnucleicacid,clinicaldiagnosisofinfectiousdiseasesanddetectionofgeneticallymodifiedorganismsetc，Threepairsofprimers，designedfromknownsequencesofaerolysingene，areu

7、sedtoamplifyfragmentsofthesanlegenefromaeromon丛hy．drophilawiththegenomeDNA船templatebyloop-mediatedisothermalamplification．Thefinalproductsarestem-loopDNA谢tllseveralinvertedrepeatsofthetargetandcauliflower-likestructureswithmultipleloops．Wehaveestablishedthenewmethodo

8、fdetectionofaeromonashy．drophilasuccessfully．Asaresult,ThebesttemperatureofLAMPissixtyfourdegree．LAMPcalldetectthirty-eightfg／tubc，