环介导等温扩增技术检测沙门氏菌方法的建立

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1、全日制硕士专业学位（毕业）论文环介导等温扩增技术检测沙门氏菌方法的建立学位申请人：李阳指导教师：刘聚祥教授学位名称：兽医硕士研究领域：不区分研究领域授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月三日分类号：S855.1+2单位代码：10086密级：公开学号：20169200800环介导等温扩增技术检测沙门氏菌方法的建立DevelopmentofaLoop-mediatedisothermalamplificationforDetectiononsalmonella学位申请人：李阳指导教师：刘聚祥教授学位名称：兽医硕士研究领域：不区分研

2、究领域授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月三日摘要沙门氏菌是引起食源性疾病的重要人畜共患病原菌之一，对人和畜禽健康具有极大危害。因此，建立一种特异、快速、灵敏的检测方法一直是沙门氏菌检测研究的核心问题。传统的检测方法步骤繁琐、周期长。各种PCR检测方法敏感、快速，因需昂贵的仪器设备，难以在基层检验工作中普及。环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）具有反应时间短、操作简单、灵敏度高、检测成本低等优点，广泛用于食源性疾病检测、环境检测等领域。因此，应用LAMP技术建立

3、检测沙门氏菌的方法更符合当前的需求。本研究针对沙门氏菌invA基因中的保守序列，应用primerexplorerV5软件在线设计了LAMP引物。对反应时间、反应温度、Bst酶用量、镁离子浓度、dNTP浓度以及内外引物比例等条件进行了优化，建立了LAMP反应体系（体系成分如下：浓度为5μmol/L的外引物F3/B3各1.0μL，浓度为40μmol/L的内引FIP/BIP各1.0μL，浓度为100mmol/L的MgSO41.5μL，浓度为10mmol/L的dNTPs2.5μL，BstDNAPolymeraseBuffer2.5µL，浓度为

4、8U/µL的BstDNApolymerase0.6µL，浓度为67ng/μL的DNA模板1.5μL，ddH2O补足体系到25μL），并确定了反应条件（64℃水浴40min，80℃水浴10min）。检测结果的判定，既可用凝胶成像系统观察扩增产物电泳后产生的特异条带情况，也可肉眼观察有无焦磷酸镁白色沉淀（浊度变化），还可通过添加显色指示剂观察颜色变化。本研究分别对钙黄绿素、羟基萘酚蓝和SYBRGreenI的添加量进行了优化，优化后的最佳添加量分别为100μmol/L、180μmol/L，2μL×1000。最终选择较稳定的SYBRGreen

5、I作为显色指示剂。用建立的LAMP方法对2株沙门氏菌标准菌和5株非沙门氏菌进行了检测，结果显示本方法对鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的检测结果均呈阳性，而对5株非沙门氏菌的检测结果均呈阴性，表明该方法特异性良好。同时进行了沙门氏菌培养液的灵敏度检测，并与PCR检测方法进行了比较，结果表明，本试验建立的LAMP方法检测沙门氏菌培养液的灵敏度为8.7CFU/mL，而PCR方法的灵敏度为870CFU/mL，LAMP方法的灵敏度是PCR方法的100倍。建立的LAMP方法对人工污染鸡蛋的检出限为9.5CFU/mL，可以用于临床检测。本研究成功建立

6、了LAMP检测沙门氏菌的新方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、方便省时和结果可视化的特点，为基层检测沙门氏菌提供了技术支持，具有很好的发展前景。关键词：沙门氏菌；环介导等温扩增；可视化；特异性；灵敏度EstablishmentofLoop-mediatedisothermalamplificationfordetectionofSalmonellaAuthor:LiYangMajor:VeterinaryMedicineAdvisor:ProfessorLiuJuxiangAbstractSalmonellaisoneoft

7、hemostimportantpathogenicbacteriacausingfoodbornediseases.Salmonellahasgreatharmtothehealthofpeopleandlivestock.Therefore,theestablishmentofaspecific,rapidandsensitivedetectionmethodhasbeenthecoreissueforSalmonelladetectionresearch.Thetraditionalmethodoftestingistedious

8、,hasalongcycle.AllkindsofPCRdetectionmethodsaresensitiveandfast,butrequireexpensiveequipment,whichmakeitdiffic