艰难梭菌毒素a羧基端基因的克隆与表达

《艰难梭菌毒素a羧基端基因的克隆与表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达作者：杨晓强，王亚东，孙勇，陈学清，姜泊【关键词】艰难梭菌；毒素A；受体结合区；克隆,分子；基因表达　　GenecloningandhighexpressionofclostridiumdifficiletoxinACterminalrepeatedunit　　　【Abstract】AIM:ToobtainthehighexpressionofthegenecodingforclostridiumdifficiletoxinAreceptorbindingzone(CDTAR).METHODS:Theclos

2、tridiumdifficiletoxinACterminalrepeatedgeneplifiedbyPCRandclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpET22b(+),andtherebinedplasmidpETCDTARedintoE.colistrainBL21(DE3).TherebinedvectoredbydigestiondifficiletoxinAreceptorgenelayafoundationforthefurtherstudyonCDTARfunctionandclost

3、ridiumdifficilevaccine.　　　【Keydifficile;toxinA;receptorbindingzone;cloning,molecular;geneexpression　　【摘要】目的：克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区(CDTAR)基因.方法：PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET22b(+)，重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)对表达产物进行分析.结果：构建了含CDTAR基因的重组质粒pETCDTAR,IPTG诱导后SDSPA

4、GE显示表达出Mr约为35.7ku的重组蛋白，占菌体总蛋白的36.1%,可溶性表达占上清的22.2%，包涵体中约占24.9%.结论：成功克隆了CDTAR基因，并构建表达了CDTAR重组蛋白，为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.　　【关键词】艰难梭菌；毒素A；受体结合区；克隆，分子；基因表达　　0引言　　艰难梭菌（clostridiumdifficile,CD）是一种G+厌氧芽孢杆菌，是医院内肠道感染的主要致病菌之一，临床上约50%的抗生素相关性腹泻和近100%的伪膜性肠炎与此菌有关［1-2］.万古霉素及甲硝唑是治疗该菌的主要

5、药物.但近年来国内外均已发现了多重耐药的菌株［3-4］；疫苗研究已经成为防治CD相关性疾病的关键.CD产生的毒素A与毒素B是其主要致病因素,毒素B通常是在毒素A作用后引起肠壁细胞损伤，而艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区(clostridiumdifficiletoxinAreceptorbindingzone,CDTAR)则是毒素A与肠壁细胞结合的关键蛋白区域［5］.研究表明，针对毒素A和B的抗体可以对CD的感染有保护作用.因此，我们拟克隆CDTAR基因，并将其在原核菌中进行表达验证，为进一步研制CD疫苗奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料

6、限制性内切酶,DNAmarkerDL2000,凝胶回收试验盒购自大连TaKaRa公司;PfuDNA聚合酶购自美国Promega公司；T4DNA连接酶购自美国Invitrogen公司；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质（蛋白质marker）购自上海西巴生物技术开发有限公司；其它试剂均为国产分析纯.引物由上海生工生物有限公司合成；CD标准株VPI10463购自兰州生物制品研究所，并由南方医科大学南方医院消化病研究所实验室保存；质粒pET22b(+)和受体大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）为南方医院消化病研究所CD疫苗研究课题小组保存

7、.　　1.2方法　　1.2.1艰难梭菌毒素A受体结合区基因的扩增采用碱裂解法提取CD基因组DNA，以艰难梭菌基因组DNA为模板，设计并合成引物：在上游引物5′设计EcoRI位点，5′TCCGAATTCGGCCTCAACTGGTTATACAAGT3′，下游引物5′设计XhoI位点，5′GTGCTCGAGAGGGGCTTTTACTCCATCAAC3′，100μL反应体系中加入10×PCR缓冲液10μL,25mmol/LdNTPs8μL，上下游引物各1μL,基因组DNA1μL,Pfu酶2.5U，灭菌双蒸水补充至100μL，反应条件：94℃预变性5mi

8、n，然后进行如下循环，94℃变性45s,60℃退火45s,72℃延伸60s,35循环后72℃终延伸10min，10g/L琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.P