抗艰难梭菌毒素b受体结合区单克隆抗体射血及初步应用研究

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1、万方数据中图分类号＆丝鱼：5UDC鱼lQ硕士学位论文学校代码!Q533密级公珏抗艰难梭菌毒素B受体结合区单克隆抗体制备及初步应用研究ThePreparationandPreliminaryApplicationofMonoclonalAntibodiestoClostridiumDifjqcileToxinBReceptorBindingRegion作者姓名：陈伟学科专业：I临床医学研究方向：临床检验诊断学学院(系、所)：湘雅医院指导教师：刘文恩教授一臌席盈中南大学二O一四年五月万方数据学位原创性声明lllIII籼呲吣叭Ⅲ圳咖帅帆Y2684455本人声明，所呈交的学位论文是本人在导

2、师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者‘签名：醛i羔日期：型望年』月4日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据

3、库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：醯盎日期：，立生，年．生月罩日导师签名毕日期：互l盟吐月4日万方数据硕士学位论文中文摘要l抗艰难梭菌毒素B受体结合区单克隆抗体制备及初步应用研究摘要目的：(1)探讨艰难梭菌毒素B受体结合区(CDB3)融合蛋白诱导表达最佳条件，分析其表达形式，并对其进行纯化。(2)制备抗CDB3单克隆抗体，纯化抗体并检测其特性。(3)建立一种双抗夹心ELISA，并用于临床腹泻患者粪便标本的艰难梭菌毒素B的检测。研究方法：(1)以诱导前菌液浓度(OD600)、诱导温度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间为单变

4、量分别诱导融合蛋白表达，采用正交试验确定优化的融合蛋白表达条件，通过SDS．PAGE分析其表达形式，通过Westernblot鉴定，并用GSTSefmoseTMKit对融合蛋白进行纯化。(2)用纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术制备抗CDB3单克隆抗体，筛选阳性杂交瘤细胞，采用腹腔注射法大量制备抗体，鉴定其亚型并采用ProteinG琼脂糖凝胶对其进行纯化，检测其浓度、分子量、效价、特异性、相对亲和力，并对其进行表位分析。(3)用改良过碘酸钠氧化法对4A4G2单克隆抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)，通过棋盘滴定法建立并优化双抗夹心ELISA检测体系，并用该体系检测已经

5、厌氧产毒培养确定的临床腹泻艰难梭菌感染患者的粪便标本。结果：(1)CDB3融合蛋白诱导表达最佳条件是诱导前菌液浓度OD600为O．8、IPTG浓度为0．6mmol／L、诱导时间为12h及诱导温度为30℃，经SDS．PAGE确定融合蛋白以可溶性蛋白表达形式为主，纯化后纯度可达90％以上，经Westemblot证实为目的蛋白。(2)经传统的杂交瘤技术，共获得5株克隆化阳性杂交瘤细胞株，亚型鉴定结果为1E782IgGl(九)、1F8D3IgM(K)、2F8A6IgG2a(1()、386F1IgM(九)和4A4G2IgGl(K)，采用辛酸．硫酸铵粗提和ProteinG琼脂糖凝胶亲和层析法对

6、1E782、2F8A6和4A4G2单克隆抗体进1本课题受参湘发改高技资助项目1201311132号资助万方数据硕士学位论文中文摘要行纯化，纯化效果90％以上，其分子量约160KD，检测其浓度分别为21．43}tg／mL、53．321xg／mL和30．08}tg／mL，相对亲和力4A4G2>2F8A6>1E782，经Westernblot验证均为抗CDB3特异性抗体，其中2F8A6与4A4G2作用于CDB3不同表位。(3)成功制得酶标抗体HRP．4A4G2，用棋盘滴定法建立并优化了双抗夹心ELISA检测体系，厌氧产毒培养鉴定的15株A+B+型阳性标本用双抗夹心ELISA检测7株阳性(

7、46．67％)，15株A’B+型标本检测8株阳性(53．33％)，15份CD阴性标本检测全为阴性。结论：(1)成功诱导CDB3融合蛋白表达并对其进行纯化，其表达形式以可溶性蛋白为主。(2)成功建立了5株阳性杂交瘤细胞株，其中2F8A6与4A4G2为IgG型，具有较高的浓度和效价，且两者作用于CDB3不同表位。(3)双抗夹心ELISA检测体系特异度较高，但灵敏度较低，其检测体系还有待进一步改进。图26幅，表5个，参考文献46篇。关键词：艰难梭菌；毒素B；受体结合区；诱导