环媒恒温基因扩增技术在动物医学上的应用概况.pdf

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1、研究环媒恒温基因扩增技术在动物医学上的应用概况*黄微罗超肖紫兰冯帅媚廖艳（湖南农业大学东方科技学院检疫实验室410128）摘要：环媒恒温基因扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification简称LAMP）是于2000年由日本科学家Notomi[1]等发明的一种新的核酸扩增技术。大量研究证明，LAMP法不仅实现了恒温条件下基因快速扩增，而且具有操作简单、快速高效、特异性强、灵敏度高、鉴定简便等特点。通过众多科研工作者的努力，目前该方法已经逐步应用于动物医学领域，如奶牛胚胎性别检测以及上多种动物病源微生物的检测，

2、发展前景可观。关键词：环介导等温基因扩增技术；核酸扩增技术；动物医学（3）敏感性强：已有学者试验证明LAMP的敏感性比1LAMP法的简介PCR强[1]。1.1LAMP的基本原理（4）因为有四条引物可以识别6个模版特异位点，所以LAMP的基本原理[1]是：采用四条特异引物（F3、B3、异性非常高[1]。FIP、BIP）识别目的基因，在60℃~65℃通过DNA聚合酶的（5）不需要PCR仪等贵重仪器，只需要水浴锅就可以完催化对核酸进行快速扩增。扩增反应包括两大步骤：链置换成试验，反应成本降低。反应和环介导循环扩增。（6）不但可以扩增DNA，也可以

3、用来反转录扩增，即就1.2LAMP的基本操作步骤是RT-LAMP[3][4][5]。LAMP技术操作十分简单方便[1，2]，只要将反应体系放（7）检测扩增产物时不但可用凝胶电泳法观察，也可以置于60℃~65℃环境（水浴锅或PCR仪均可）约15~90分钟，在紫外灯下观察，甚至直接用肉眼观察到产物。然后于放置于80℃环境3分钟将DNA聚合酶灭活即可。检（8）扩增的温度条件几乎不需要摸索：从60℃到65℃[1]，测结果可以用比浊仪或凝胶电泳判断。而且通常有2~3度的温度跨度。1.3LAMP法的主要优点（9）在同一个反应体系中，非靶DNA的存在对其

4、扩增LAMP技术主要优点体现在以下几个方面：无显著影响[1]。（1）模版链不需要将双链变性成单链，整个扩增反应处2LAMP法在动物医学上的研究进展于恒温条件下进行。（2）扩增反应速度特别快，只要15分钟到90分钟。2.1LAMP技术在动物病原生物检测上的研究进展作者简介：肖紫兰（1987-），女，本科，湖南邵阳人，动植物检疫专业。通讯作者：罗超（1981-），男，硕士，湖南益阳人，实验员，动植物检疫专业。54中中国畜禽种业国畜禽种业2008.11研究大量研究证明，LAMP技术病原体的检测上有速度快和明[21]等应用LAMP技术13枚雌性胚和

5、3枚雄性胚胎给受体牛特异性高，敏感性强等优点，突破了传统的PCR技术，是动移植，妊娠率达45.5%，性别鉴定的准确率为100%。另外张物医学的分子检测技术一大进步。值得一提的是，日本的立、黄春华等成功的应用LAMP技术检测奶牛胚胎性别。目EIKEN株式会社在最初设计4条引物扩增的基础上又增加了前日本生产的奶牛胚胎检测检测试剂盒已经应用于畜牧生产两条Loop引物，从而使扩增速度进一步加快，甚至只要15第一线。分钟就可以完成扩增反应。另外，LAMP技术应用于禽流感2.3基于LAMP技术的产品开发以及生产实际中的应用病毒[6]、疱疹病毒[7]、白

6、斑综合症病毒[8]等病毒的检测，推广证明了RT-LAMP发展成熟。目前，LAMP技术已经应用于目前基于LAMP技术开发出来的检测试剂盒有11种，约20种动物医学上常见的病源生物检测（详见表1），为以其中可以应用于动物医学领域的有：RT-LAMP试剂盒以及后进一步研究和应用打好了结实的基础。DNALAMP扩增试剂盒，专门用于动物医学方面的有奶牛胚2.2LAMP技术牛胚胎性别检测上研究应用胎性别LAMP检测试剂盒，此外还有配套的检测设备：HirayamaH等[20]充分利用LAMP法的反应速度快、特LAMP比浊仪和实时LAMP比浊仪。为了使检测

7、结果的判断异性强等特点，应用到奶牛早期胚胎性别鉴定上。其原理是迅速、直观，EIKEN株式会社利用SYBRGreenI实施可视通过设计四条特异性引物F3、B3、BIP和FIP识别雄性Y—化检测：向扩增产物中加入一微升稀释的SYBRGreenI，如染色体短臂上SRY基因，从而鉴定早期胚胎的性别。黄金果混合产物从橘黄色变为绿色就可判断样品为阳性。该方法2008.11中中国畜禽种业国畜禽种业55研究106[5]PhamHM，NakajimaC，OhashiK，etal.Loop-mediatedisothermalamplifi-cationfor

8、rapiddetectionofNewcastlediseasevirus[J].ClinMicrobiol.2005，43（4），1646-1650[6]ShanthiJ，Ch