sybr_green实时定量pc_省略_ero宿主细胞dna残留量的检测_胡广宏

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1、ChineseJournalofNewDrugs2012，21(10)·实验研究·SYBR-Green实时定量PCR用于Vero宿主细胞DNA残留量的检测11112胡广宏，寇桂英，包红，余黎，周旭(1兰州生物制品研究所有限责任公司，兰州730046;2上海生物制品研究所有限责任公司，上海200052)［摘要］目的:建立基于SYBR-Green荧光染料实时定量PCR检测Vero宿主细胞DNA残留量的方法。方法:提取Vero细胞基因组DNA，设计细胞基因组高度重复顺序AGMr(HindIII)-1基因片段的特异性引物，通过PCR扩增AGMr(HindII

2、I)-1序列中一段特异性cDNA片段，克隆至pGEM-TVector，重组质粒经酶切及测序鉴定合格后命名为pGEM-T/AGMr(HindIII)-1-S。结果:使用重组质粒和细胞基因组DNA分别作为检－1－1测标准品，均取得了良好的结果，其检测灵敏度分别达到了0．03fg·μL和0．03pg·μL。结论:SYBR-Green实时定量PCR可用于Vero宿主细胞DNA残留量的准确定量。［关键词］实时定量;Vero细胞;细胞基因组DNA;重组质粒;残余DNA［中图分类号］R186［文献标志码］A［文章编号］1003－3734(2012)10－1152－

3、05DetectionofresidualVerocellDNAbySYBR-Greenreal-timePCR11112HUGuang-hong，KOUGui-ying，BAOHong，YULi，ZHOUXu(1LanzhouInstituteofBiologicalProducts，Lanzhou730046，China;2ShanghaiInstituteofBiologicalProducts，Shanghai200052，China)［Abstract］Objective:ToestablishSYBR-Greenreal-timePCRt

4、odetecttheresidualVerocellDNA．Methods:ExtractedVerocellgenomicDNA;designedthelongtandemrepeatsequence(LTR)genespecificprimerandobtainedthecDNAofAGMr(HindIII)-1fragment．Clonethelongtandemrepeatsequence(LTR)ofgenomicDNAofVerocellstopGEM-TVector，insert-positiveclonesofpGEM-T/AGMr(

5、HindIII)-1-Swereobtainedbyre-strictionanalysisandsequencing．Results:GoodresultswereobtainedwhenusingpGEM-T/AGMr(HindIII)-1-SandVerocellgenomicDNAasstandardRespectively．ThesensitivityofthedevelopedquantitativePCRmethodwas0．3fgand300fgrespectively．Conclusion:SYBR-Greenreal-timePC

6、RmethodmightbeusedforquantitationofresidualVerocellDNAinvaccine．［Keywords］real-timequantitative;Verocell;genemicDNA;recombinantplasmid;residualDNAVero细胞广泛应用于多种疫苗的生产，作为传方法对于疫苗安全性质控至关重要。目前，WHO推代细胞，其风险在于细胞残余DNA具有潜在的致瘤荐的标准是每剂量制品中的终DNA含量必须小于性。因此，建立准确定量制品中细胞DNA残留量的10ng，美国FDA建议使用检测灵敏度

7、达到10pg的检测方法检测制品中的DNA水平，我国药典规［基金项目］国家科技支撑计划(2008BAI66B08)定每剂量疫苗中的Vero细胞DNA残留量必须少［作者简介］胡广宏，男，医学生物工程师，主要从事病毒性疫苗的于100pg。研究工作。E-mail:zhongkuang333@163．com。［通讯作者］周旭，女，研究员，研究方向为病毒性疫苗的研制。E-Vero细胞中的高度重复顺序AGMr(HindIII)-1mail:kathzhou@sina．com。占基因组的19．3%，适于作为实时定量检测用的靶1152中国新药杂志2012年第21卷第1

8、0期ChineseJournalofNewDrugs2012，21(10)基因。本试验克隆了其全长(172b