犬细小病毒山东分离株基因组序列克隆测序分析以及sybr green i荧光定量pcr检测方法的建立

《犬细小病毒山东分离株基因组序列克隆测序分析以及sybr green i荧光定量pcr检测方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据GenomicsequenceanalysisofcanineparvovirusisolatedfromShandongProvinceanddevelopmentofSYBRGreenIreal．．．timePCRfordetectionofcarnl·voreparvoviruses’’’‘esis：ubmittedt0111eSlSSQngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgro

2、nomy，一一YuYongle(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：Prof．ShanHUllanuQingdao，ChinaJune，2014万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文

3、中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：孑意岖、时间：历，争年多月，争日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：寺永6、时间：切仫年阴修日导师签名：时间：乃，争年钼他日万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要犬细小病毒山东分离株基因组序列克

4、隆测序分析以及SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法的恁卫摘要犬细小病毒(Canineparvovirus,cev)在分类上属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus)，已在全世界多个国家迅速传播和蔓延，是目前公认的引起犬及犬科动物出血性肠炎和心肌炎的重大病原之一。犬细小病毒最显著的生物学特性就是其VP2基因高的进化速率，从1979-2000年，CPV-2发生了几次重要的基因变异，先后产生了CPV-2a、CPV·2b、NewCPV-2a和NewCPV-2b、CPV-2c(a)

5、和CPV-2e(b)以及CPV-2c七种抗原变异株。为了解山东地区犬细小病毒的流行及其遗传变异情况，对四株分离株的全基因组进行克隆测序与序列分析。CPV，FPLV(猫细小病毒)和MEV(水貂肠炎病毒)三者的基因序列一致性高达98％pX上，具有紧密的亲缘关系。通过血凝、中和试验、普通PCR方法很难区分，而通过基因组酶切，单克隆抗体，基因组测序等手段又过于繁琐，所以建立一种区分不同细小病毒简便的PCR-RFLP方法，更易于病毒检测判断。常规PCR技术可以快速、特异的检测很少拷贝数的CPV，但不能准确定量、易出现交叉污

6、染产生假阳性。实时荧光定量PCR技术因其特异性强、灵敏度高、可进行定量测定等优点已被广泛应用于临床疾病诊断。本文主要从以下三方面开展了相关研究：试验一犬细小病毒山东分离株基因组序列克隆测序分析根据GenBank发表的CPV全基因序列设计6对引物，对本实验室分离保存的四株细小病毒(QNl／QN2／QN3／QN4)进行全基因的扩增和测序分析。结果表明，除QN3株的基因组全长为4756nt外，其余3株均为4757nt；4个分离株之间全序列核苷酸同源性为99．31％，与GenBank登录的10株具有代表性的CPV核苷酸序

7、列比对，同源性为98．2％．99．9％；VP2基因的核苷酸序列同源性为98．5％．99．9％，氨基酸序列同源性为98．1％．100％；表明各分离毒株的亲缘关系较近，同属于NewCPV-2a亚型。试验二CPV和MEVPCR．RFLP鉴别检测方法的建立通过对国内外提交的CPV和MEV野毒株、疫苗株及其它参考毒株的VP2基因序列比较发现，MEVVP2基因核苷酸308位的碱基为T，对应序列为TGTACA是BSP14071酶识别位点，而CPVVP2基因核苷酸308位的碱基为C，对应序列为TGCACA不能被BSP1407I酶

8、识别，致使MEV比CPV多了1个限制性内切酶BSP1407I酶切位万方数据专岛农业大学硕士学位论文摘要点。利用特异性引物扩增出1016bp的目的片段后，再用此酶进行酶切分析，MEV毒株可以切成】睨、312，602bp3个片段，CPV毒株可以切成414、602bp2个片段，且酶切重复性、特异性和敏感性试验结果良好。对28份临床疑似样品进行检测，并对检出的8株CPV毒株和3株