犬瘟热、犬细小病毒二重实时荧光定量pcr检测方法的建立及应用

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1、第1章犬瘟热、犬细小病毒二重实时焚光定量PCR检测方法的建立及应用1.1材料l.i.i菌(毒〉株及样品92份已知CDV/CPV阴性的犬粪便均由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存；48份临床疑似样品采自郑州某宠物门诊。1.1.2主要试剂磁珠法核酸全自动提取试剂盒购自Ambion^物科技公司；TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0冋收试剂盒、dNTPs、DNA聚合酶等均购自宝生物工程(大连)冇限公司；JM109感受态细胞、pGEM-TEasy载体、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂均购tlProm

2、ega公司；Trizol试剂购自GibcoRBL公司。1.1.3主要仪器设备实时荧光定量PCR仪(ABI7000)购自美国ABI公司；PCR扩增仪购自徳国Biometra公司；凝胶成像分析系统购自美国AlphaInnotech公司；KingFisher令自动核酸提取仪购自美国Thermo公司；紫外分光光度计(UV-2450)购自日本岛津公司；台式高速冷冻离心机购自美国Heraeus公司；恒温水浴锅购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司。1.1.4常用溶液和培养基(4)TE缓冲液(1L)量取100mllmol/LTris-Hcl缓冲液，20ml500mmo

3、l/LEDTA置于IL烧杯中，向烧杯中加入约800ml的灭菌水溶解混匀，并将溶液定容至1L,之后高温高压灭菌，保存于室温环境。(6)50xTAEBuffer(200ml)称量48.4gTris，7.44gNa2EDTA.2H2O于200ml烧杯中，加入约100ml灭菌水，充分溶解混匀，加入11.42ml的乙酸，混匀，加入灭菌水定容至200ml后，于室温环境保存。(7)IPTG(10ml)称量0.24gIPTG置于10ml离心管中，加入5ml灭菌水溶解混匀后定容至10ml,然后用0.22pm细菌滤器对混合液过滤除菌，适量分装后，于-20°C保存。(6)

4、X-Gal(10ml)称量0.2gX-Gal置于10ml离心管中。加入8mlDMF溶液，溶解混匀后定容至10ml,适量分装后，于-20°C避光保存。1.2方法1.2.1pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV阳性质粒标准品的制备采取同样方法提取CPV细胞培养物、正常FK81细胞、CPV临床阳性样品、临床疑似CPV感染的犬唾液、粪便等待检样品、CAV-1、CAV-2、无CDV/CPV感染的健康犬幾便的总DNA。核酸提取按照Ambion生物科技公司磁珠法核酸全自动提取试剂盒说明书进行，具体操作如下：取96孔（12x8）核酸提取板，每一列自上而下依次标记

5、为A->F孔，按照操作说明书，对每一孔所添加试剂及待检样品的量如下表所示：（2）总RNA的反转录置于37°C恒温水浴锅反应1h，结束后，将反转录产物直接用于后续试验或-20°C保存备用。（3）目的片段的PCR扩增将反转录的CDVcDNA取2叫加入CDVPCR体系中，PCR体系总体积为25

6、iL,各成分如下：加入到CPVPCR体系中，PCR体系总体积为25pL，各成分如下：最后72°C延伸lOmin,取出扩增产物用于凝胶电泳分析。（4）扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析①凝胶的配置：按照所需浓度，以lxTAE电泳缓冲液配置凝胶液，微波炉加热使完全溶解。待冷却

7、到60°C左右加入核酸染色剂GoldView（至终浓度力5（ig/ml）,趁热倒入模具，凝胶厚度在0.4〜0.7cm之间，大约20min后，凝胶凝固，小心拔出梳子，将平板放入电泳槽中。②样：向样pTj中加入适量6>

8、7〜10V/cm之间，当GoldView电泳至适当位置（约15min）,关闭电源，将凝胶置于凝胶成像系统观察、拍照。（5）目的片段的回收及鉴定根据宝生物工程（大连）有限公司TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0试剂盒说明？5，进行目的片段的回收：①用干净的手术刀片将455bp片段和559bp片段的目的片段琼脂凝胶(1%)切下，放入己称过重量的离心管中，进行二次称重，计算凝胶块净重。②按lmg胶快=1(iL进行换算，将凝胶块捣碎并加入3倍体职的BufferGM溶液。③在室温15〜25°C条件下，采

9、用间断振荡混合法，使胶块充分融化。(6)回收的目的片段与pGEM-TEasy载体的连接根据Promcga公司